[發(fā)明專利]一種表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110270376.4
• 申請(qǐng)日: 2021-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN113151026A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱佑民;鐘誠(chéng);于婷婷;張慧;鄭業(yè)鴻;雷雨;孟維龍;張文薈;林莉莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海國(guó)龍生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/62;C12N15/81;C12N9/42;C12N9/40;A23K10/14;A23K20/189;C12R1/84
• 代理公司: 南京禾易知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32320
• 代理人: 張松云

1.一種表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、化學(xué)合成如SEQ ID No.1所示的β-甘露聚糖酶和如SEQ ID No.2所示的α-半乳糖苷酶的基因序列；

S2、酶切S1中所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列并與酶切線性化的畢赤酵母表達(dá)載體分別連接或重組，得β-甘露聚糖酶基因表達(dá)質(zhì)粒和α-半乳糖苷酶基因表達(dá)質(zhì)粒；

S3、將S2中構(gòu)建好的β-甘露聚糖酶基因表達(dá)質(zhì)粒和α-半乳糖苷酶基因表達(dá)質(zhì)粒酶切線性化后分別或混合轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中；

S4、通過His缺陷和G418抗性篩選出有基因插入的畢赤酵母菌，然后通過PCR方法篩選出分別或同時(shí)含有β-甘露聚糖酶基因和α-半乳糖苷酶基因的陽性克隆菌株，得到能夠分別或同時(shí)表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母；

所述β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的核苷酸序列兩端包含EcoRI和Not1酶切位點(diǎn)序列和載體pPIC9K的同源臂序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，所述S2中β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列與酶切線性化的畢赤酵母表達(dá)載體通過T4連接酶或2X ClonExpress Mix連接或重組。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，所述S3中表達(dá)質(zhì)粒采用Sacl酶切線性化。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)質(zhì)粒線性化后跑1%的agarose瓊脂糖凝膠確認(rèn)重組質(zhì)粒完全線性化。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，將完全線性化的所述表達(dá)質(zhì)粒等量或等比例混合后，轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中，200-240 rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)1h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，所述S4中PCR監(jiān)測(cè)過程中，依據(jù)所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶所示的檢測(cè)引物對(duì)初步篩選所得的畢赤酵母菌進(jìn)行檢測(cè)，挑選出同時(shí)整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的畢赤酵母菌株。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，其特征在于，將所述同時(shí)整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的畢赤酵母菌株跑SDS-PAGE膠鑒定分泌蛋白，挑選得β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因表達(dá)量高的菌株。

8.基于權(quán)利要求1-7所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，獲取一種表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母，其特征在于，所述畢赤酵母中包含β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的基因序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母，其特征在于，所述畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒包括載體pPIC9K和EcoRI酶切位點(diǎn)與Not1酶切位點(diǎn)之間的全長(zhǎng)基因如β-甘露聚糖酶基因以及α-半乳糖苷酶基因。

10.一種表達(dá)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

將畢赤酵母工程菌株轉(zhuǎn)接入含有15mL BMGY培養(yǎng)基帶透氣塞的50mL離心管，在28-30℃，200-240 rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)至OD600=2-6；

菌體重懸于BMM培養(yǎng)基，200-240 rpm條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每24h加0.5%甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)4-6天；

c、應(yīng)用：將β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶作為飼料添加劑應(yīng)用于降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子半乳甘露聚糖。