[發明專利]一種檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法

在審

• 申請號: 202110268247.1
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN113092760A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 王宏婷;王存琴;汪榮斌;陳穎;臧莉;黃超;蔣永旭;孫緒強
• 申請（專利權）人: 皖南醫學院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/545;G01N33/548;G01N33/68
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 范奇

1.一種檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、將抗體加入離心柱中進行固化處理；

步驟二、瓊脂糖基質預處理細胞裂解液；

步驟三、將固化處理后的抗體置于瓊脂糖基質預處理細胞裂解液上進行處理；

步驟四、進行免疫共沉淀洗脫；

步驟五、對洗脫后的流穿液進行SDS-PAGE分析，檢測目的蛋白之間的相互作用。

2.根據權利要求1所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述步驟一中固化處理的方法包括步驟如下：

A1、預處理第一離心柱后，向第一離心柱中加入HER2抗體、交聯緩沖液及超純水；

A2、在室溫條件下，經混旋儀孵育、離心后保留第一離心柱。

3.根據權利要求2所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述步驟A1中交聯緩沖液的溶質為0.01M Na₃PO₄，0.15M NaCl；pH為7.2。

4.根據權利要求2所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述步驟二中預處理細胞裂解液的方法包括如下步驟：

B1、將細胞經改性緩沖液清洗后，加入預冷的IP裂解/洗滌緩沖液，冰上孵育后離心；

B2、向第二離心柱中添加瓊脂糖樹脂漿液，經離心及加交聯緩沖液后再次離心處理得含有樹脂的第二離心柱；

B3、將細胞裂解液加入含有樹脂的第二離心柱中，經孵育、離心后，保留流穿液體；其中，細胞裂解液與瓊脂糖樹脂漿液的質量體積比為1:80mg/μL。

5.根據權利要求4所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述B1中采用改良型杜氏PBS緩沖液及IP裂解/洗滌緩沖液裂解HCC1806乳腺癌細胞。

6.根據權利要求5所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述改良型杜氏PBS的溶質為0.008M Na₃PO₄、0.002M K₃PO₄、0.14MNaCl、0.01M KCl；pH為7；IP裂解/洗滌緩沖液的溶質為0.025M Tris，0.15MNaCl，0.001M EDTA，1％NP-40，5％甘油；pH為7.4。

7.根據權利要求4所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述步驟三中處理的方法是將B3得到的流穿液體加入到A2處理后的第一離心柱中，經離心后保留流穿液。

8.根據權利要求1所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述步驟一中加入抗體的質量為10-75μg，溶液體積調整至200μL。

9.根據權利要求1所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述步驟一中通過共價偶聯抗體至胺基活化樹脂。

10.根據權利要求1所述檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，其特征在于，所述步驟五中采用非還原型泳道標記上樣緩沖液，其溶質包括0.3MTris·HCl，5％SDS，50％甘油，泳道標記示蹤染料；pH為6.8。