[發明專利]一種檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法

在審

• 申請號: 202110268247.1
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN113092760A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 王宏婷;王存琴;汪榮斌;陳穎;臧莉;黃超;蔣永旭;孫緒強
• 申請（專利權）人: 皖南醫學院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/545;G01N33/548;G01N33/68
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 范奇

本發明提供了一種檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，包括如下步驟：步驟一、將抗體加入離心柱中進行固化處理；步驟二、瓊脂糖基質預處理細胞裂解液；步驟三、將固化處理后的抗體置于瓊脂糖基質預處理細胞裂解液上進行處理；步驟四、進行免疫共沉淀洗脫；步驟五、對洗脫后的流穿液進行SDS?PAGE分析，檢測目的蛋白之間的相互作用。本發明方法簡單有效，特異性好，且準確率極高。進一步地簡化了實驗操作，縮短了實驗時間。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法。

背景技術

蛋白質與蛋白質之間相互作用構成了細胞生化反應網絡的一個主要組成部分，蛋白-蛋白互作網絡與轉錄調控網絡對調控細胞及其信號有重要意義。而現階段常用的檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法主要有酵母雙雜交系統，pull-down技術等。酵母雙雜交系統其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于報告基因的啟動子，啟動報告基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報告基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。

以上第一種方法中雜交系統分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應在核內無法進行。而第二種方法可能會出現假陽性。也許是因為電荷作用的影響造成的吸附，而不是生理性的相互作用。而且Pull-down一般是驗證體外相互作用，并不能用于檢測細胞水平的體內相互作用。

發明內容

本發明旨在解決現有技術中存在的技術問題。為此，本發明提供一種檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，目的是提高蛋白純度及特異性，準確檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用。

基于上述目的，本發明提供了一種檢測蛋白質與蛋白質相互作用的方法，包括如下步驟：

步驟一、將抗體加入離心柱中進行固化處理；

步驟二、瓊脂糖基質預處理細胞裂解液；

步驟三、將固化處理后的抗體置于瓊脂糖基質預處理細胞裂解液上進行處理；

步驟四、進行免疫共沉淀洗脫；

步驟五、對洗脫后的流穿液進行SDS-PAGE分析，檢測目的蛋白之間的相互作用。

所述步驟一中固化處理的方法包括步驟如下：

A1、預處理第一離心柱后，向第一離心柱中加入HER2抗體、交聯緩沖液及超純水；

A2、在室溫條件下，經混旋儀孵育、離心后保留第一離心柱。

所述步驟A1中交聯緩沖液的溶質為0.01M Na₃PO₄，0.15M NaCl；pH為7.2。

所述步驟二中裂解處理的方法包括如下步驟：

B1、將細胞經改性緩沖液清洗后，加入預冷的IP裂解/洗滌緩沖液，冰上孵育后離心；

B2、向第二離心柱中添加瓊脂糖樹脂漿液，經離心及加交聯緩沖液后再次離心處理得含有樹脂的第二離心柱；

B3、將細胞裂解液加入含有樹脂的第二離心柱中，經孵育、離心后，保留流穿液體；其中，細胞裂解液與瓊脂糖樹脂漿液的質量體積比為1:80mg/μL。

將B3得到的流穿液體加入到A2處理后的第一離心柱中，經離心后保留流穿液。

所述B1中采用改良型杜氏PBS緩沖液及IP裂解/洗滌緩沖液裂解HCC1806乳腺癌細胞。