[發(fā)明專利]VacA重組蛋白的制備、復(fù)性和保存方法

在審

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• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN113005133A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王芬;袁玲芝;肖士郎;蔡婷;陳冰
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C07K14/195;C07K1/14;C07K1/22;C07K1/34;C07K1/36;C07K1/113
• 代理公司: 長沙軒榮專利代理有限公司 43235
• 代理人: 李喆

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及VacA重組蛋白的制備、復(fù)性和保存方法。包括：獲取VacA基因序列，經(jīng)PCR擴增后構(gòu)建VacA重組表達載體；將所述表達載體轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌中，經(jīng)擴增培養(yǎng)后加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達，獲得菌液；將所述菌液離心后取細菌沉淀物，采用裂解緩沖液對所述細菌沉淀物超聲裂解，獲得細胞裂解物；將所述細胞裂解物純化后獲得VacA重組蛋白；將所述VacA重組蛋白采用pH＝2.9的醋酸緩沖液進行透析復(fù)性并保存，上述制備、復(fù)性和保存方法能夠獲得高活性VacA重組蛋白，能夠誘導(dǎo)細胞凋亡。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及VacA重組蛋白的制備、復(fù)性和保存方法。

背景技術(shù)

VacA毒素是Hp最重要毒力因子之一，VacA蛋白在慢性胃炎-癌的發(fā)病機制中扮演著非常重要的角色。

目前缺乏統(tǒng)一的VacA毒素高效表達體系，使基于VacA結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)研究受到阻礙。研究表明，從Hp中提取的天然VacA產(chǎn)量少，工作量大且純化困難；從Hp分泌上清中收集的VacA毒素粗純液成分復(fù)雜多樣，難以解釋分析蛋白功能；而傳統(tǒng)的VacA重組蛋白多不具有活性，需在體外用HCl激活后才具有生物活性。因此，如何獲得高產(chǎn)量且具有生物活性的VacA重組蛋白具有重要的科學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明成功構(gòu)建了VacA重組質(zhì)粒，在大腸埃希菌內(nèi)誘導(dǎo)表達重組蛋白,所述VacA重組蛋白在pH 2.9的醋酸緩沖液進行復(fù)性和保存，且復(fù)性保存后的VacA重組蛋白具有促凋亡的生物活性。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的在于提供一種VacA重組蛋白的制備、復(fù)性和保存方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

獲取VacA基因序列，經(jīng)PCR擴增后構(gòu)建VacA重組表達載體；

將所述表達載體轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌中，經(jīng)擴增培養(yǎng)后加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達，獲得菌液；

將所述菌液離心后取細菌沉淀物，采用裂解緩沖液對所述細菌沉淀物超聲裂解，獲得細胞裂解物；將所述細胞裂解物純化后獲得VacA重組蛋白；

將所述VacA重組蛋白采用pH＝2.9的醋酸緩沖液進行透析、復(fù)性并保存。

進一步的，所述VacA基因序列PCR擴增的條件為：

引物序列為：

F1:5'caatcgttggcggcatcgctacgggtacggctgttggcacggtttcgggcctgcttagttggggactc3'；

F:5'ctttaagaaggagatatacatatgtttttcaccacggttatcattccggcaatcgttggcggcatcgct3'；

反應(yīng)條件如下：96℃預(yù)變性5min；96℃30秒，57℃30秒，72℃1分20秒，72℃5分鐘。

進一步的，將所述表達載體轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌中，經(jīng)擴增培養(yǎng)后加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達，獲得菌液步驟，具體包括：

將表達載體轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌中，涂布K⁺平板，37℃培養(yǎng)過夜，再將單個菌落接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)入含K⁺的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；

當(dāng)細胞增殖生長曲線在600nm達到OD＝1.2時，加入0.5mM異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達，獲得菌液。

進一步的，所述采用裂解緩沖液對所述細菌沉淀物超聲裂解，獲得細胞裂解物步驟具體包括：

采用裂解緩沖液三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液對所述細菌沉淀物在超聲功率為500W，超聲3s，間歇3s，超聲15min，獲得細胞裂解物。