[發明專利]VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法

在審

• 申請號: 202110265719.8
• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN113005133A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 王芬;袁玲芝;肖士郎;蔡婷;陳冰
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅三醫院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C07K14/195;C07K1/14;C07K1/22;C07K1/34;C07K1/36;C07K1/113
• 代理公司: 長沙軒榮專利代理有限公司 43235
• 代理人: 李喆

1.一種VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

獲取VacA基因序列，經PCR擴增后構建VacA重組表達載體；

將所述表達載體轉化到大腸埃希菌中，經擴增培養后加入誘導劑誘導蛋白表達，獲得菌液；

將所述菌液離心后取細菌沉淀物，采用裂解緩沖液對所述細菌沉淀物超聲裂解，獲得細胞裂解物；將所述細胞裂解物純化后獲得VacA重組蛋白；

將所述VacA重組蛋白采用pH＝2.9的醋酸緩沖液進行透析、復性并保存。

2.根據權利要求1所述的VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，所述VacA基因序列PCR擴增的條件為：

引物序列為：

F1:5'caatcgttggcggcatcgctacgggtacggctgttggcacggtttcgggcctgcttagttggggactc3'；

F:5'ctttaagaaggagatatacatatgtttttcaccacggttatcattccggcaatcgttggcggcatcgct3'；

反應條件如下：96℃預變性5min；96℃30秒，57℃30秒，72℃1分20秒，72℃5分鐘。

3.根據權利要求1所述的VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，將所述表達載體轉化到大腸埃希菌中，經擴增培養后加入誘導劑誘導蛋白表達，獲得菌液步驟，具體包括：

將表達載體轉化到大腸埃希菌中，涂布K⁺平板，37℃培養過夜，再將單個菌落接種至含有卡那霉素的LB培養基培養過夜，轉入含K⁺的LB培養基培養；

當細胞增殖生長曲線在600nm達到OD＝1.2時，加入0.5mM異丙基硫代半乳糖苷誘導劑誘導蛋白表達，獲得菌液。

4.根據權利要求1所述的VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，所述采用裂解緩沖液對所述細菌沉淀物超聲裂解，獲得細胞裂解物步驟具體包括：

采用裂解緩沖液三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液對所述細菌沉淀物在超聲功率為500W，超聲3s，間歇3s，超聲15min，獲得細胞裂解物。

5.根據權利要求1所述的VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，所述細菌裂解物經離心后獲得第一上清液和包涵體沉淀。

6.根據權利要求5所述的VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，將所述細菌裂解物中的第一上清液進行純化獲得VacA重組蛋白具體包括：

采用Ni-IDA樹脂，以裂解緩沖液為柱平衡緩沖液，并以含咪唑的裂解緩沖液進行梯度洗脫，獲得VacA重組蛋白。

7.根據權利要求5所述的VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，將所述細菌裂解物中的包涵體沉淀進行純化獲得VacA重組蛋白具體包括：

將所述包涵體沉淀溶于變性緩沖液并超聲裂解，經離心后獲得第二上清液，將所述第二上清液采用Ni柱，以變形緩沖液作為柱平衡緩沖液和洗滌緩沖液洗脫雜蛋白，并以含有咪唑的洗滌緩沖液進行洗脫，獲得VacA重組蛋白。

8.根據權利要求7所述的VacA重組蛋白的制備、復性和保存方法，其特征在于，所述變性緩沖液為：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和尿素的復配溶液；所述洗滌緩沖液為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、尿素、聚氧乙烯單叔辛基苯基醚和氯化鈉復配溶液。