[發(fā)明專利]一種鑒定植物根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110262656.0
• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN112813154A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫蔚旻;孫曉旭;李寶琴;馬克斯·科爾頓;林瀚智;高品;黃裕青
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

本發(fā)明公開了一種鑒定植物根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因的方法。本發(fā)明利用優(yōu)化的內(nèi)生菌高效提取技術(shù)，把根表微生物去除徹底，結(jié)合宏基因組?單菌草圖組裝技術(shù)，去除植物宿主質(zhì)體和線粒體的干擾，獲得純根內(nèi)生菌的菌群信息，再進(jìn)一步對根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因進(jìn)行鑒定。本發(fā)明方法通過內(nèi)生菌高效提取技術(shù)，能夠把根表微生物去除徹底，大大降低了根表微生物殘留對判斷根內(nèi)生菌群功能的影響；另外，把根內(nèi)生菌DNA提取后，利用宏基因組?單菌草圖組裝技術(shù)，可以在不明確植物宿主基因序列的情況下，對植物宿主質(zhì)體和線粒體進(jìn)行直接去除。本發(fā)明方法可以避開根系中根際、根表等微生物的干擾，直接了解植物根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定植物根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因的方法。

背景技術(shù)

植物內(nèi)生菌具有重要的環(huán)境生態(tài)和植物生理作用。有研究表明，根內(nèi)微生物可以促進(jìn)宿主植物體的生長，增強(qiáng)宿主植物對病原體、養(yǎng)分缺乏、金屬污染等脅迫的抗逆性，在環(huán)境污染治理和生態(tài)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的巨大應(yīng)用潛力。

雖然近些年在植物根部內(nèi)生菌的生態(tài)和生理作用方面展開了一系列的研究，但還有許多問題需要進(jìn)一步探討。例如，由于絕大多數(shù)微生物無法通過純培養(yǎng)技術(shù)獲得，大量的內(nèi)生菌仍然未被發(fā)現(xiàn)，植物根部內(nèi)生菌的作用機(jī)理仍然不清，內(nèi)生菌對植物根部的相互作用有待深入認(rèn)識等。

目前，學(xué)界也不斷發(fā)展基于不同分子生物學(xué)技術(shù)的非培養(yǎng)研究，而各種非培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)就是提取高質(zhì)量的基因組DNA，以及排除植物宿主本身的質(zhì)體和線粒體的干擾。因此，需要一種能去除植物根表微生物及植物宿主干擾的研究方法，來幫助深入了解植物根部內(nèi)生菌對污染物(例如砷)的抗性及代謝作用機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容

現(xiàn)有技術(shù)由于很難排除植物宿主本身的質(zhì)體和線粒體干擾，因此少有對植物根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因的鑒定研究。為了克服這個技術(shù)缺陷，本發(fā)明利用優(yōu)化的內(nèi)生菌高效提取技術(shù)，把根表微生物去除徹底，結(jié)合宏基因組-單菌草圖組裝技術(shù)，去除植物宿主質(zhì)體和線粒體的干擾，獲得純根內(nèi)生菌的菌群信息，再進(jìn)一步對根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因進(jìn)行鑒定。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種鑒定植物根內(nèi)生菌群落功能及其功能基因的方法，包括以下步驟：

(1)去除植物根表雜菌

抖落植物根表附著土，將植物根依次置于MgSO₄溶液、含有Tween 20的MgSO₄溶液、MgSO₄溶液、含有Tween 20的次氯酸鈉溶液、MgSO₄溶液中旋渦震蕩或超聲處理，去除植物根表雜菌；

MgSO₄極容易吸收水分，利用MgSO₄能使細(xì)菌脫水，從而達(dá)到殺菌的目的。此外，MgSO₄還是一種強(qiáng)氧化劑，可以進(jìn)一步破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。旋渦震蕩或超聲處理目的是使緩沖液和植物根部充分接觸，除菌更徹底。

步驟(1)和(2)所述的MgSO₄溶液優(yōu)選濃度為10mM；

步驟(1)所述含有Tween 20的MgSO₄溶液，Tween 20的濃度為0.01％(v/v)；

步驟(1)所述含有Tween 20的次氯酸鈉溶液，次氯酸鈉濃度為1％(v/v)，Tween 20的濃度為0.01％(v/v)；

(2)分離內(nèi)生菌并提取總DNA

將去除根表雜菌的植物根在MgSO₄溶液中破壁勻漿，濾布過濾取濾汁；濾汁在500×g下離心10min，將上清液再于9500rpm下離心15min，利用離心形成重量差，重量較大的細(xì)菌細(xì)胞會沉到底部，保留菌體細(xì)胞沉淀物；