[發明專利]一種鑒定植物根內生菌群落功能及其功能基因的方法

在審

• 申請號: 202110262656.0
• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN112813154A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 孫蔚旻;孫曉旭;李寶琴;馬克斯·科爾頓;林瀚智;高品;黃裕青
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院生態環境與土壤研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

1.一種鑒定植物根內生菌群落功能及其功能基因的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)去除植物根表雜菌

抖落植物根表附著土，將植物根依次置于MgSO₄溶液、含有Tween 20的MgSO₄溶液、MgSO₄溶液、含有Tween 20的次氯酸鈉溶液、MgSO₄溶液中旋渦震蕩或超聲處理，去除植物根表雜菌；

(2)分離內生菌并提取總DNA

將去除根表雜菌的植物根在MgSO₄溶液中破壁勻漿，濾布過濾取濾汁；濾汁在500×g下離心10min，將上清液再于9500rpm下離心15min，保留菌體細胞沉淀物；

將菌體細胞沉淀物重懸于無菌NaCl溶液中，再緩慢加入到碘海醇溶液上方，然后于15000×g下離心60min，回收乳白色條帶部分；隨后去除回收部分的碘海醇，加入等體積的無菌NaCl溶液，在7500×g下離心20min，去除上清液后加入無菌NaCl溶液重新懸浮；最后于7500×g下離心20min，取沉淀，加入無菌NaCl溶液重懸，即為回收的內生菌，提取內生菌總DNA；

(3)內生菌宏基因組DNA測序及分析

3.1、建立根內生菌的DNA宏基因組文庫，獲得原始測序Reads；利用Trimmomatic-0.36進行測序數據質控，過濾低質量數據；進行序列拼接，得到Contigs；進行序列比對，把Contigs的獨立數據集的Reads進行映射用來評估其豐度；利用KEGG數據庫對Contigs進行序列物種注釋；利用Blobtools進行可視化，根據序列種屬、GC比以及覆蓋度，結合Bowtie評估的豐度，對原始序列進行過濾，去除植物宿主序列；對Contigs使用默認設置的CONCOCT、Metabat2、Maxbin2進行組裝，并利用Metawrap對所得的MAG進行提純，得到高質量的宏基因組拼接基因組(MAGs)；

3.2、取完整度50％和冗余度10％的MAGs進行下游分析，分析這些MAGs所屬的門類，基于Ghostkoala比對KEGG數據庫中污染物代謝相關功能基因，若MAG序列中具有與數據庫高度相似的基因序列，則認為MAG中具有該功能基因，檢測這些MAG中是否含有相同的碳氮硫代謝的相關功能基因序列；

利用blastp比對抗生素及金屬抗性功能數據庫，對比分析MAGs所含的植物促生基因與污染物代謝相關功能基因序列；

利用Salmon工具將所得到的MAG在宏基因組中對各個基因拷貝數進行定量，通過MAGs中各功能基因拷貝數判斷植物根部內生菌參與關鍵物質循環的強度，所含碳氮硫等典型關鍵元素代謝的基因拷貝數越大，證明所參與的關鍵營養元素循環作用越重要，污染物抗性及代謝基因拷貝數越大，則對污染物抗性表現越強、利用污染物參與自身代謝的作用越強。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)和(2)所述的MgSO₄溶液，濃度為10mM。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)所述含有Tween 20的MgSO₄溶液，Tween 20的濃度為0.01％(v/v)。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)所述含有Tween 20的次氯酸鈉溶液，次氯酸鈉濃度為1％(v/v)，Tween 20的濃度為0.01％(v/v)。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)所述濾布的孔徑為25μm。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)所述無菌NaCl溶液的濃度為0.8％(W/V)。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)所述碘海醇溶液的濃度為1.3g/ml。