[發明專利]一種合成抗癌藥物中間體的重組大腸桿菌及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110262205.7
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN112980864A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 李永安;刁劉洋;周亞維;於四杰
• 申請（專利權）人: 百繕藥業（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N15/60;C12N9/02;C12N9/06;C12N9/88;C12N1/21;C12P17/18;C12P17/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種合成抗癌藥物中間體的重組大腸桿菌及其構建方法和應用。所述重組大腸桿菌含有的重組質粒攜帶編碼L?色氨酸氧化酶、CPA合成酶和兩種單加氧酶的核苷酸序列；所述L?色氨酸氧化酶為VioA，所述CPA合成酶為VioB。本發明中，L?色氨酸氧化酶、CPA合成酶和兩種單加氧酶的組合在大腸桿菌中能夠正常表達，并且能夠以L?色氨酸為底物高效合成CPA及抗癌藥物中間體，為抗癌藥物的篩選和研發提供了基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種重組大腸桿菌及其構建方法和應用，尤其涉及一種合成抗癌藥物中間體的重組大腸桿菌及其構建方法和應用。

背景技術

癌癥嚴重威脅人類健康，其誘發因素往往源于信號通路中激酶的異常活化。另外，自身免疫病、神經退行病等常見高發慢性病也與激酶異常密切相關。2001年，第一個激酶抑制劑類藥物格列衛(Gleevec)在美獲批上市，開啟了癌癥靶向治療新時代，療效顯著優于化療。截至2019年底，FDA共批準了52個激酶抑制劑。雖然數量較多，但由于癌癥種類繁多、涉及的異常激酶眾多且變異類型多樣、以及使用后耐藥等因素，癌癥在臨床上仍存在重大未滿足的治療需求。另外，這些上市藥物僅靶向大約25個激酶，僅占人體518個激酶中的5％，尚有大量激酶暫未成藥。因此，這類藥物研發空間巨大。

抗腫瘤新藥主要來源于天然產物類似物。因此，有效合成天然產物類似物的創新技術對于新藥發現來說至關重要。天然產物往往結構復雜，含有多個手性中心。相對于化學合成，因具有嚴格的區域和立體選擇性，生物合成更有優勢。尤其是合成生物學原理與技術的日益成熟，使得天然產物類似物的有效合成易于實現。

雙吲哚生物堿是一類含有兩個吲哚基團的天然產物，代表化合物為具有抗腫瘤活性的星孢菌素(Staurosporine)和蝴蝶霉素(Rebeccamycin)。星孢菌素是一種來源于放線菌的天然產物，具有廣譜強效的激酶抑制活性。據不完全統計，星孢菌素能夠有效抑制200多種人體激酶，多個激酶的半抑制濃度(IC50)能夠達到nM級別。蝴蝶霉素也是一種來源于放線菌的天然產物，具有強效的拓撲異構酶和激酶抑制活性。開發雙吲哚生物堿類似物的有效合成技術，是促成這類化合物廣泛成藥的關鍵因素。

星孢菌素的生物合成基因簇DNA序列在2002年被測定，天然合成酶系被初步識別。隨后，多個天然合成酶如StaO、StaD、StaP、StaC等的催化活性在體外生化實驗中得到證實，式I顯示了星孢菌素的生物合成途徑，其中R基團表示＝O或者＝NH，兩者可逆。

蝴蝶霉素的生物合成基因簇DNA序列也在2002年被測定，天然合成酶系被初步識別，式II顯示了蝴蝶霉素的生物合成途徑，其中R基團表示＝O或者＝NH，兩者可逆。

對比式I和式II可知，星孢菌素與蝴蝶霉素的生物合成途徑極其相似，其中，StaO與RebO系同工酶，StaD與RebD系同工酶，StaP與RebP系同工酶，但StaC與RebC非同工酶，StaC催化K252c的合成，而RebC催化1,11-二氯-Arcyriaflavin A的合成。

基于已鑒定的星孢菌素和蝴蝶霉素的生物合成途徑酶系，研究人員在異源宿主白色鏈霉菌(Streptomyces albus)體內實現了多個雙吲哚生物堿類似物的生物合成，例如，以色氨酸為起始使用酶組合RebO，RebD，RebP和StaC實現了K252c的合成，以色氨酸為起始使用酶組合RebO，RebD，RebP和RebC實現了Arcyriaflavin A的合成，然而，上述組合均在白色鏈霉菌中表達，且產量均未知。

因此，提供一種合成星孢菌素和蝴蝶霉素中間體的生物合成路徑和生產菌株對于提高星孢菌素和蝴蝶霉素的產量，以及對抗癌藥物的篩選和研發而言具有重要的意義。

發明內容