[發明專利]一種合成抗癌藥物中間體的重組大腸桿菌及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110262205.7
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN112980864A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 李永安;刁劉洋;周亞維;於四杰
• 申請（專利權）人: 百繕藥業（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N15/60;C12N9/02;C12N9/06;C12N9/88;C12N1/21;C12P17/18;C12P17/16;C12R1/19
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒攜帶編碼L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶和兩種單加氧酶的核苷酸序列；

其中，所述L-色氨酸氧化酶為VioA，所述CPA合成酶為VioB。

2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述兩種單加氧酶為RebP和SpcC的組合或RebP和RebC的組合；

優選地，所述重組質粒攜帶編碼L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、單加氧酶RebP和單加氧酶SpcC的核苷酸序列；或者，

所述重組質粒攜帶編碼L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、單加氧酶RebP和單加氧酶RebC的核苷酸序列。

3.根據權利要求1或2所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒包括大腸桿菌表達質粒；

優選地，所述大腸桿菌表達質粒包括pETDuet系列、pACYCDuet系列、pRSFDuet系列、pCOLADuet或pCDFDuet系列表達載體中的任意一種，進一步優選為pCDFDuet系列表達載體。

4.根據權利要求1～3任一項所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒上，編碼L-色氨酸氧化酶的核苷酸序列和編碼CPA合成酶的核苷酸序列相連，編碼單加氧酶的核苷酸序列相連；

優選地，所述核苷酸序列之間通過核糖體結合位點相連。

5.一種重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌包含如權利要求1～4任一項所述的重組質粒。

6.根據權利要求5所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌的抗癌藥物中間體的產量不低于10μM；

優選地，所述抗癌藥物中間體包括K252c和/或Arcyriaflavin A。

7.根據權利要求5或6所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌為含有所述重組質粒的商業化大腸桿菌和/或經人工改造的大腸桿菌；

優選地，所述重組大腸桿菌為含有所述重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)。

8.一種如權利要求5～7任一項所述的重組大腸桿菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：

將如權利要求1～4任一項所述的重組質粒通過電轉化或者化學轉化的方法轉入大腸桿菌，得到所述重組大腸桿菌。

9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述重組質粒的構建方法包括：

將合成的編碼L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶和兩種單加氧酶的核苷酸序列通過酶切、連接的方式插入大腸桿菌表達質粒，得到所述重組質粒；

優選地，所述酶切的方式為雙酶切；

優選地，所述雙酶切的位點組合包括酶切位點NcoI和BamHI的組合和/或酶切位點NdeI和XhoI的組合。

10.如權利要求1～4任一項所述的重組質?；蛉鐧嗬?～7任一項所述的重組大腸桿菌在制備抗癌藥物或抗癌藥物中間體中的應用；

優選地，所述抗癌藥物包括星孢菌素和/或蝴蝶霉素。