[發(fā)明專利]一種雜交楓香遺傳轉(zhuǎn)化的方法

有效

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• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN112877356B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設計）人: 張金鳳;江帥菲;齊帥征;孔立生;趙健;范英明;崔瑩;趙瑞瑞;劉寶平;李靜;李珊珊;樊萍;張進帥
• 申請（專利權）人: 北京林業(yè)大學;神舟綠鵬農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 喻蓉

本發(fā)明公開了一種雜交楓香胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于植物基因工程技術領域。本發(fā)明方法包括：采用農(nóng)桿菌對雜交楓香愈傷組織進行浸染處理，然后將浸染處理后的愈傷組織接種于篩選培養(yǎng)基上進行抗性愈傷組織的篩選培養(yǎng)。通過對抗性愈傷組織的PCR陽性鑒定，利用本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化方法可在短時間內(nèi)獲得大量陽性抗性愈傷，即通過利用農(nóng)桿菌介導法，建立雜交楓香高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，本發(fā)明方法楓香遺傳轉(zhuǎn)化效率高，對于培育楓香新品種和基因功能驗證具有重要意義。

技術領域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因工程技術領域，具體涉及一種以胚性愈傷組織為受體材料，根癌農(nóng)桿菌介導的雜交楓香遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術

楓香屬(Liquidambar L.)植物為金縷梅科楓香亞科的高大落葉喬木，具有極高的觀賞價值、使用價值和生態(tài)價值。常綠闊葉樹種多數(shù)在秋季葉片變黃，逐漸凋落，而楓香在秋季經(jīng)歷較大的晝夜溫差后，葉片逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，是優(yōu)良的觀賞樹木，唐朝詩人杜牧即有“停車坐愛楓林晚，霜葉紅于二月花”的贊嘆。同時，楓香樹形優(yōu)美，木材堅硬，作建筑用材有“梁閣千年楓”之說，是制造家具、膠合板和包裝材料的理想用材。此外，楓香樹有較為突出的生態(tài)價值，其涵養(yǎng)水源能力強，落葉量大，能優(yōu)化土壤結構，改善林地生境。其中，以中國楓香為父本，北美楓香為母本進行控制授粉所獲得的雜交楓香在生長性狀方面表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢。

遺傳轉(zhuǎn)化是指同源或異源的游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程。根據(jù)感受態(tài)建立方式，可以分為自然遺傳轉(zhuǎn)化(natural genetic transformation)和人工轉(zhuǎn)化(artificialtransformation)，前者感受態(tài)的出現(xiàn)是細胞一定生長階段的生理特性；后者則是通過人為誘導的方法，使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內(nèi)。

目前楓香屬植物轉(zhuǎn)基因研究普遍以葉片為受體材料的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，例如許林、劉冉冉、雷莎等人對楓香葉片進行預培養(yǎng)3d后，使用OD₆₀₀為0.5的農(nóng)桿菌菌液對其進行侵染，侵染10min，25℃共培養(yǎng)4d后進行篩選培養(yǎng)，初步獲得21株陽性轉(zhuǎn)化苗；又如喬桂榮等人使用OD₆₀₀為0.5的農(nóng)桿菌菌液對楓香葉片進行侵染，侵染8～10min，25℃共培養(yǎng)3d后進行篩選培養(yǎng)，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株；Sullivan和Lagrimini(1993)利用含有gus：nptII的農(nóng)桿菌對北美楓香葉片進行侵染，侵染7min，28℃共培養(yǎng)3d，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。上述方法雖然獲得了轉(zhuǎn)基因植株，但是使用葉片進行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率低，且易產(chǎn)生嵌合體，而且器官發(fā)生培養(yǎng)程序復雜，培養(yǎng)周期長。

本發(fā)明方法基于高效的雜交楓香體細胞胚胎發(fā)生體系，使用胚性愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化，一方面，愈傷組織分化程度低，顯著減少嵌合體發(fā)生，是優(yōu)良的受體材料；另一方面，體胚發(fā)生所需時間短，通過體細胞胚胎發(fā)生途徑中獲得高密度、高質(zhì)量的體胚苗，比器官發(fā)生效率更高，大大縮短育種周期，加速功能驗證的進程。

目前國內(nèi)尚未有雜交楓香胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究，對進行雜交楓香遺傳改良和基因功能研究造成了巨大障礙。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有楓香屬植物遺傳轉(zhuǎn)化中存在培養(yǎng)程序復雜、培養(yǎng)周期長等技術不足，提供了一種雜交楓香胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的方法，通過采用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法對胚性愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化，為雜交楓香的遺傳轉(zhuǎn)化、品質(zhì)改良和基因功能驗證提供了一個新途徑。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種雜交楓香胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括采用農(nóng)桿菌對雜交楓香愈傷組織進行浸染處理，然后將浸染處理后的愈傷組織接種于篩選培養(yǎng)基上進行抗性愈傷組織的篩選培養(yǎng)。

其中，所述農(nóng)桿菌選用EHA105農(nóng)桿菌。