[發(fā)明專利]一種雜交楓香遺傳轉(zhuǎn)化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110261828.2
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN112877356B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設計）人: 張金鳳;江帥菲;齊帥征;孔立生;趙健;范英明;崔瑩;趙瑞瑞;劉寶平;李靜;李珊珊;樊萍;張進帥
• 申請（專利權）人: 北京林業(yè)大學;神舟綠鵬農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 喻蓉

1. 一種雜交楓香胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是，包括如下順序進行的步驟：

1）制備浸染菌液

將EHA105農(nóng)桿菌接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行液體懸浮培養(yǎng)，直至菌液的濃度OD₆₀₀達到0.2-0.8，制得浸染菌液，其中，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：改良Blaydes基本培養(yǎng)基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA 0-1 mg/L+ AS 50-100μM；

2）浸染處理

首先，將雜交楓香的胚性愈傷組織進入浸染菌液中，進行振蕩處理；接著倒掉浸染菌液，并吸干愈傷組織表面的浸染菌液；然后將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至用共培養(yǎng)培養(yǎng)基潤濕的濾紙上，于黑暗條件下進行浸染-共培養(yǎng)處理，獲得浸染愈傷組織，其中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：改良Blaydes基本培養(yǎng)基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA0-1 mg/L+ AS 50-100μM；

3）恢復培養(yǎng)

首先用含有頭孢霉素的無菌水沖洗浸染愈傷組織3-4次，其中所述含頭孢霉素的無菌水中頭孢霉素的濃度為300-400mg/L；沖洗時間為15-25min/次；接著吸干愈傷組織表面的液體；然后將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復培養(yǎng)基中，進行恢復培養(yǎng)，獲得恢復培養(yǎng)愈傷組織，其中所述恢復培養(yǎng)基為：改良Blaydes基本培養(yǎng)基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+ 植物凝膠0.5-3%+ 2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA 0-1 mg/L+Cef 300-400mg/L；

4）篩選培養(yǎng)

將恢復培養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中，進行篩選培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織，其中所述篩選培養(yǎng)基為：改良Blaydes基本培養(yǎng)基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+ 植物凝膠0.5-3%+ 2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA 0-1 mg/L+Cef 300-400 mg/L +Hyg 0-20 mg/L；

其中所述改良Blaydes基本培養(yǎng)基配方如下（mg/L）：

3]]>	1000
4.7H2O]]>	71.5
2PO4]]>	300
2.2H2O]]>	210
KCl	71.5
4NO3]]>	1000
3)2·4H2O]]>	500
4·4H2O]]>	6.06
4·7H2O]]>	4
3BO3]]>	2
KI	0.6
2MoO4·2H2O]]>	0.0025
4·5H2O]]>	0.025
2·6H2O]]>	0.025
2EDTA·2H2O]]>	37.2
4·7H2O]]>	27.8
肌醇	2
煙酸	0.1
維生素B6	0.1
維生素B1	1。