[發(fā)明專利]一種重組高純度的非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110261349.0
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN115073557A
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張強;錢泓;吳有強;賈寶琴;徐玉蘭;聞雪
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/34;C12N15/866;A61K39/12;A61P31/20;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發(fā)明公開了一種重組高純度的非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白及其制備方法和應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述制備方法如下：1)重組桿狀病毒獲得：將密碼子優(yōu)化后的非洲豬瘟病毒pK205R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的表達基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8中，然后與線性化的DNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，得到含有非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白表達基因的重組桿狀病毒；2)發(fā)酵培養(yǎng)：再將所述重組桿狀病毒進行擴大培養(yǎng)后進行發(fā)酵，收集培養(yǎng)液；3)亞單位蛋白純化：對步驟2)中所述培養(yǎng)液進行純化，純化后得到重組的非洲豬瘟病毒pK205R亞單位可溶性蛋白。本發(fā)明能夠提供一種可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的非洲豬瘟蛋白pK205R亞單位蛋白且制備方法簡單、成本低能夠達到國家現(xiàn)有標準。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種高純度非洲豬瘟pK205R蛋白大規(guī)模制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率及死亡率高達100％。豬感染非洲豬瘟病毒后出現(xiàn)皮膚充血，內(nèi)臟器官出血，高熱為特征臨床癥狀，豬是ASFV自然感染的唯一哺乳動物宿主，包括家豬和野豬，尤其是家豬，易感性極高，對畜牧業(yè)影響巨大。世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類疫病，我國也將其列為一類動物傳染病。

該病最早在1921年于非洲的肯尼亞國家確認發(fā)生，對非洲乃至全球多個國家的養(yǎng)豬業(yè)造成極大打擊。2018年8月份以來，在我國多個省份爆發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。雖然，國內(nèi)外學(xué)者對非洲豬瘟做了大量的研究工作，但研究發(fā)現(xiàn)：常規(guī)制備的非洲豬瘟滅活苗效果不明顯，而弱毒苗保護效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效預(yù)防非洲豬瘟的疫苗和治療該病的藥物發(fā)現(xiàn)，迫切需要新型疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)來預(yù)防非洲豬瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的蟲媒DNA病毒。病毒顆粒呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，平均直徑200nm，表面有含糖脂類的囊膜覆蓋。其病毒基因組為雙股線性DNA，大小為170-190kb，整個基因組大約有150個ORF，編碼150-200中蛋白質(zhì)。K205R基因是一早期轉(zhuǎn)錄基因，目前對該基因研究較少，推測該基因可能參與病毒的組裝。pK205R蛋白由K205R基因編碼的病毒蛋白，pK205R蛋白能較早刺激機體產(chǎn)生抗體，對病毒感染早期的診斷和治療具有重要作用。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的診斷ASFV的方法主要是病原鑒定和血清學(xué)試驗，病原鑒定存在操作繁瑣或者儀器昂貴、存在生物安全的風險等一系列缺點；在血清學(xué)檢測技術(shù)中，ELISA是OIE規(guī)定的國際貿(mào)易檢驗方法，但需要制備檢測抗原，當前的技術(shù)存在的缺陷是不能在原核表達系統(tǒng)中大規(guī)模表達，且純化后的蛋白純度較低，本發(fā)明成功構(gòu)建一種能高表達pK205R蛋白的重組桿狀病毒，并結(jié)合簡單快速的純化方法，得到大量高純度的pK205R蛋白，且得到的pK205R蛋白不論是在空間結(jié)構(gòu)，還是在翻譯后修飾等方面與天然蛋白更為接近，能提高檢測方法的特異性，為非洲豬瘟診斷和預(yù)防提供重要幫助。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供本發(fā)明提供非洲豬瘟pK205R亞單位蛋白。本發(fā)明還提供一種非洲豬瘟pK205R亞單位蛋白的制備方法及利用該蛋白制備一種重組的高純度非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白總抗體檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種重組高純度的非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白，所述重組高純度的非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白為非洲豬瘟病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，密碼子優(yōu)化后的所述重組高純度的非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。密碼子優(yōu)化前的所述重組高純度的非洲豬瘟病毒pK205R亞單位蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種重組高純度的非洲豬瘟pK205R亞單位蛋白的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：