[發明專利]基因重組膠原寡肽的制備方法

在審

• 申請號: 202110258770.6
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN114644707A
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 羅杰
• 申請（專利權）人: 廣州星途投資運營集團有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/70;C07K1/16;C07K1/34;C07K1/36;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 佛山市智匯聚晨專利代理有限公司 44409
• 代理人: 陳欽祥

本發明公開了基因重組膠原寡肽的制備方法。基因重組膠原寡肽的制備方法，包括如下步驟：S1、采用一對互補引物PCR反應合成MYS?1基因；S2、對MYS?1基因進行雙酶切，得到重組質粒；S3、用重組質粒轉化表達宿主大腸桿菌，得到表達工程菌；S4、誘導表達工程菌表達融合蛋白；S5、進行純化：收集洗脫液；S6、融合蛋白的酶切及目的多肽MYS?1的純化；S7、利用高效液相色譜技術純化制備膠原寡肽MYS?1，得到高純度基因重組高穩定性膠原寡肽MYS?1。本發明制備的膠原寡肽長度遠小于天然人膠原蛋白及相關水解多肽，分子量小、制備容易且效率高，具有良好的抗氧化、抗衰老、促修復、抑制黑色素生成等生物活性。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及基因重組膠原寡肽的制備方法。

背景技術

膠原蛋白是一種高分子功能性蛋白質，它是皮膚的主要組成部分，占皮膚真皮層80％的比重，它在皮膚中構成了一張細密的彈力網，牢固鎖住水分,支撐著皮膚。

隨著年齡的增長，膠原蛋白會逐漸的流失，從而導致支撐皮膚的膠原肽鍵和彈力網斷裂，其螺旋網狀結構隨即被破壞，皮膚組織被氧化、萎縮、塌陷，肌膚就會出現干燥、皺紋、松弛無彈性等衰老現象，所以，女性補充膠原蛋白是一種延衰的必須。膠原蛋白之父布蘭特博士斷言：“根本上來講皮膚衰老過程，就是膠原蛋白流失的過程”。長期服用翌生美LOC膠原蛋白，不僅能幫您修復斷裂、老化的纖維彈力網、穩固其結構造型，更能讓您擁有一個屬于自己的“真皮水庫”。當真皮層的膠原纖維彈力網被氧化、斷裂后，對表皮的支撐作用就消失了，水分就無法鎖住和儲存；因此造成不均一的塌陷，這樣皺紋就產生了。

目前，膠原蛋白生產主要有傳統提取、化學合成及基因重組制備技術。傳統提取技術通過水解天然膠原得到系列水解產物，但其免疫原性的應用風險難以避免；化學合成膠原蛋白的成本高；基因重組技術具有產率高、成本低、生產的蛋白、多肽或寡肽活性高、無病毒隱患等優勢，使得基因重組小分子膠原多肽具有良好的產業化前景，具有巨大的市場應用潛力。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有抗衰老效果的基因重組膠原寡肽的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案，基因重組膠原寡肽的制備方法，如下步驟：

S1、采用一對互補引物PCR反應合成MYS-1基因；

S2、用KpnI酶和XhoI酶分別對質粒pET32a和步驟S1制得的MYS-1基因進行雙酶切，然后將雙酶切后的MYS-1基因和雙酶切后的質粒pET32a，得到重組質粒pET32a-MYS-1；

S3、用重組質粒pET32a-MYS-1轉化表達宿主大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，得到表達工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)；

S4、誘導表達工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)表達由Trx標簽蛋白、His標簽蛋白和膠原寡肽MYS-1等組成的融合蛋白；

S5、表達的帶His標簽的融合蛋白用鎳柱進行純化：在蛋白上樣后，帶有His標簽的融合蛋白特異性結合鎳柱，其他的雜蛋白因不特異性結合鎳柱而流出；用咪唑梯度洗脫，因咪唑與Ni2+結合可競爭性結合鎳柱，進而釋放融合蛋白，收集洗脫液；

S6、融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的純化；

S7、利用高效液相色譜技術純化制備膠原寡肽MYS-1，得到高純度基因重組高穩定性膠原寡肽MYS-1；

其中步驟S1中的引物為：

引物1：

引物2：