[發明專利]基因重組膠原寡肽的制備方法

在審

• 申請號: 202110258770.6
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN114644707A
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 羅杰
• 申請（專利權）人: 廣州星途投資運營集團有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/70;C07K1/16;C07K1/34;C07K1/36;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 佛山市智匯聚晨專利代理有限公司 44409
• 代理人: 陳欽祥

1.基因重組膠原寡肽的制備方法，包括如下步驟：

S1、采用一對互補引物PCR反應合成MYS-1基因；

S2、用KpnI酶和XhoI酶分別對質粒pET32a和步驟S1制得的MYS-1基因進行雙酶切，然后將雙酶切后的MYS-1基因和雙酶切后的質粒pET32a，得到重組質粒pET32a-MYS-1；

S3、用重組質粒pET32a-MYS-1轉化表達宿主大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，得到表達工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)；

S4、誘導表達工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)表達由Trx標簽蛋白、His標簽蛋白和膠原寡肽MYS-1等組成的融合蛋白；

S5、表達的帶His標簽的融合蛋白用鎳柱進行純化：在蛋白上樣后，帶有His標簽的融合蛋白特異性結合鎳柱，其他的雜蛋白因不特異性結合鎳柱而流出；用咪唑梯度洗脫，因咪唑與Ni2+結合可競爭性結合鎳柱，進而釋放融合蛋白，收集洗脫液；

S6、融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的純化；

S7、利用高效液相色譜技術純化制備膠原寡肽MYS-1，得到高純度基因重組高穩定性膠原寡肽MYS-1；

其中所述步驟S1中的引物為：

引物1：

引物2：

GGTACC為KpnI酶切位點，CTCGAG為XhoI酶切位點；

所述步驟S1中PCR反應的條件為：保持95℃5分鐘，進行30次溫度循環并最后保持70℃10分鐘，所述溫度循環為1分鐘95攝氏度轉至1分鐘50℃再轉至1分鐘70℃。

2.根據權利要求1所述的基因重組膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述步驟S5中，采用平緩緩沖液和洗滌緩沖液，所述平緩緩沖液的組成包括：50mMNa2HPO4，0.3MNaCl，pH＝8.0；

所述洗滌緩沖液包括如下成分：50mMNa2HPO4，0.3MNaCl，10～50mMimidazole，pH＝8.0。

3.根據權利要求1所述的基因重組膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述步驟S5中，所述洗脫鎳柱的溶液的組成優選如下：50mMNa2HPO4，0.3MNaCl，250mMimidazole，pH＝8.0。

4.根據權利要求1所述的基因重組膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述步驟S6中，所述融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的純化步驟如下：

(1)將融合蛋白洗脫液置于1×PBS(pH7.6)緩沖液中透析，透析后融合蛋白溶液加入腸激酶(EK，5IU/μL)，加入量為每500μg融合蛋白加入5U腸激酶，酶切條件是：25℃條件下酶切6h；

(2)將酶切后的溶液體系過平衡好的Ni-NTA純化柱，收集穿透液，用含250mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫柱子上的標簽蛋白和其他結合雜蛋白，洗脫總體積為柱床的5倍，再生Ni-NTA純化柱，收集的穿透液即為含有膠原寡肽MYS-1的初步純化產物。

5.根據權利要求1所述的基因重組膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述步驟S7中，所述的利用高效液相色譜技術純化膠原寡肽MYS-1的步驟如下：

A、流動相A為在體積百分比100％乙腈中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的終濃度為體積百分比0.1％；流動相B為100％水中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0.1％；流速1.0mL/min，20min線性梯度洗脫；

B、線性梯度洗脫中流動相B由55％～80％(v/v)，收集膠原寡肽MYS-1的洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm；并進行質譜鑒定。