[發(fā)明專利]一種促進DNT細胞擴增與活化的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110254851.9 | 申請日： | 2021-03-09 |
| 公開（公告）號： | CN112961828A | 公開（公告）日： | 2021-06-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 傅松濤 | 申請（專利權(quán)）人： | 傅松濤 |
| 主分類號： | C12N5/0784 | 分類號： | C12N5/0784;C12N5/0783 |
| 代理公司： | 北京世譽鑫誠專利代理有限公司 11368 | 代理人： | 仲伯煊 |
| 地址： | 100000 北京市大興區(qū)亦莊*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 促進 dnt 細胞 擴增 活化 方法 | ||
1.一種促進DNT細胞擴增與活化的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)、制備腫瘤細胞膜抗原粗液；
(2)、腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞培養(yǎng)；
(3)、腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞外囊泡制備；
(4)、利用腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞外囊泡促進DNT細胞擴增與活化。
2.如權(quán)利要求1所述的一種促進DNT細胞擴增與活化的方法，其特征在于，步驟(1)包括以下步驟：
(11)、對于來自外科手術(shù)或活檢瘤組織，用生理鹽水清洗2～3次后，在無菌條件下用滅菌的剪刀和鑷子剔除脂肪、筋膜和大血管，稱重后用手術(shù)剪刀將腫瘤組織切成1～5立方毫米的小塊后，放入無菌的組織研磨器中，加入1～5倍腫瘤組織重量/體積的預(yù)冷細胞裂解液，將組織研磨器置于冰水浴中進行腫瘤組織的研磨和均質(zhì)，得到組織均漿，其中：
腫瘤組織的重量以克計；
預(yù)冷細胞裂解液以毫升計；
(12)、將步驟(11)所得的組織勻漿經(jīng)300～500目無菌細胞篩網(wǎng)過濾，濾液收集在無菌離心管中，濾渣置于研磨器中加入1～3倍腫瘤組織重量/體積的預(yù)冷細胞裂解液再次進行研磨，再經(jīng)300～500目細胞篩網(wǎng)過濾，用1～3倍腫瘤組織重量/體積預(yù)冷細胞裂解液淋洗研磨器，并經(jīng)篩網(wǎng)濾入離心管中得到腫瘤組織裂解液，其中：
腫瘤組織的重量以克計；
預(yù)冷細胞裂解液以毫升計；
(13)、將步驟(12)所得盛放有腫瘤組織裂解液的離心管連續(xù)冷凍融化2～3次，完成后將該離心管置于離心機中以500～1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～15分鐘，收集上清液，其中：
冷凍融化的條件為：將盛放有腫瘤組織裂解液的離心管置于-80℃～-60℃條件下冷凍存儲8～24小時后，轉(zhuǎn)移到4℃～9℃條件下融解18～48小時；
(14)、在步驟(13)所得的上清液中，按重量/體積0.5％～2％的比例加入脫氧膽酸鈉離子去污劑,然后在1～8℃的條件下連續(xù)攪拌1～3小時后，40000～100000轉(zhuǎn)/分鐘離心20～60分鐘，吸去表層的油脂后，收集提取液，無菌密封后置-80℃～-60℃冰箱中保存，得到腫瘤細胞膜抗原粗液。
3.如權(quán)利要求2所述的一種促進DNT細胞擴增與活化的方法，其特征在于，步驟(11)中的外科手術(shù)或活檢瘤組織取材時避免用退變組織。
4.如權(quán)利要求2所述的一種促進DNT細胞擴增與活化的方法，其特征在于，步驟(11)中的細胞裂解液的制備包括以下步驟：
(111)配置含有0.05％～0.2％苯甲基磺酰氯、0.1％～0.6％氯化鈉的水溶液；
(112)經(jīng)115～125℃滅菌30～60分鐘后，預(yù)冷至1～5℃存放即可。
5.如權(quán)利要求1所述的一種促進DNT細胞擴增與活化的方法，其特征在于，步驟(1)包括以下步驟：
S11、將采集的胸腹水經(jīng)200～400目無菌細胞篩網(wǎng)過濾，分裝在稱過重量的刻度離心管中，用2500～3500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-30分鐘，棄上清并稱重計算沉淀物重量后，在沉淀物中加入3～10倍重量/體積的預(yù)冷細胞裂解液，用吸管吹打混合均勻，其中：
胸腹水的沉淀物以克計；
預(yù)冷細胞裂解液以毫升計；
S12、將步驟S11的離心管密封后置冰水浴中孵育10-30分鐘，用組織勻漿器以2500～3500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速上下勻漿粉碎4～8次后，然后反復(fù)凍融三次使濾液中的細胞完全裂解得到細胞凍融液，其中：凍融包括以下步驟：
將離心管放入-80℃～-60℃冰箱中凍存8～24小時，取出后置4℃～9℃水浴中融解18～48小時；
S13、將步驟S12所得的細胞凍融液分裝在高速離心管中，在1～5℃以500～1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，吸取上層液體分裝在已確定重量的高速離心管中，按重量/體積0.5％～2％的比例加入脫氧膽酸鈉離子去污劑,在1℃～8℃的條件下連續(xù)攪拌1～3小時后，以20000～50000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心20～60分鐘，吸去表層的油脂和上清液，收集沉淀物，無菌密封后置-80℃～-60℃冰箱中保存，得到腫瘤細胞膜抗原粗液。
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