[發明專利]一種促進DNT細胞擴增與活化的方法

在審

• 申請號: 202110254851.9
• 申請日: 2021-03-09
• 公開（公告）號: CN112961828A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 傅松濤
• 申請（專利權）人: 傅松濤
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0783
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理有限公司 11368
• 代理人: 仲伯煊

本發明公開了一種促進DNT細胞擴增與活化的方法，包括：(1)制備腫瘤細胞膜抗原粗液；(2)腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞培養；(3)腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞外囊泡制備；(4)利用腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞外囊泡促進DNT細胞擴增與活化。本發明具有以下有益效果：1、利用腫瘤細胞膜碎片來提供腫瘤細胞膜抗原；2、利用腫瘤細胞膜抗原粗液來激活DC細胞，制備腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞及其外分泌囊泡，使其特異性地呈遞多種腫瘤細胞膜抗原；3、利用腫瘤細胞膜抗原負載DC細胞外分泌囊泡呈遞的多種腫瘤抗原，進一步刺激DNT細胞的增殖和活化，提升DNT細胞的殺瘤作用和特異性。

技術領域

本發明屬于生物領域，涉及免疫細胞培養，具體涉及一種促進DNT細胞擴增與活化的方法。

背景技術

雙陰性T(Double Negative T，DNT)細胞是指人外周血中正常存在的CD3+CD4-CD8-的T細胞亞群，占T細胞總數1-5％。過去，DNT細胞被視為一種調節性T細胞，過繼轉移DNT細胞可以防止同種異體移植物排斥反應、移植物抗宿主病和自身免疫性糖尿病。后來，科學家逐漸發現DNT細胞對腫瘤細胞具有殺傷作用。

JB·李(lee JB)等研究表明健康志愿者來源的同種異體DNT細胞可以靶向急性髓細胞白血病(Acute Myelocytic Leukemia，AML)細胞，與傳統化療有著協同的抗腫瘤作用。KJ·楊(Young KJ)等將淋巴瘤細胞與主要組織相容性復合體(major histocompatibilitycomplex，MHC)Ⅰ類分子不匹配的脾細胞一同注入小鼠，發現超過75％的小鼠幸存下來，幸存小鼠與罹患淋巴瘤小鼠相比，外周血中DNT細胞增加了15倍。接下來的實驗證明DNT細胞對A20淋巴瘤細胞具有殺傷作用，初步證明了DNT細胞的抗腫瘤作用。S·沃爾克在淋巴瘤患者和外周血中分離出一群DNT細胞，它們可以特異性識別淋巴瘤相關抗原GP100，對于表達GP100的靶細胞和HLA-A2+GP100淋巴瘤細胞具有細胞毒作用。有學者發現體外擴增的γδ+DNT細胞對肺癌細胞具有殺傷作用。最新研究表明DNT細胞對肺癌和白血病患者標本來源的異種移植腫瘤模型有顯著的抗腫瘤作用，并且輸注同種異體的DNT細胞不會誘發移植物抗宿主病。

DNT細胞表面表達CD3分子和αβ-或γδ-T細胞受體(T Cell Receptor，TCR)，但不表達CD4和CD8分子，也不結合恒定型自然殺傷T(invariant Nature Killer T，iNKT)細胞特異性αGalCer加載的CD1d四聚物，因此不同于常規的T細胞、NK細胞和NKT細胞，DNT細胞具有NK細胞不具備的T細胞受體TCR活性，能為特異性抗原活化，具有更長的體內持續時間，是一種極有希望用于治療臨床多種腫瘤的通用型T細胞藥物。

樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC)是目前發現的功能最強的抗原遞呈細胞。DC細胞能攝取、加工及呈遞抗原，啟動T細胞介導的免疫反應。成熟DC細胞可有效的誘導抗原特異性T細胞增殖和活化，是機體抗腫瘤免疫反應的主要啟動者和參與者。

DNT細胞表面表達TCR受體能識別主要組織相容性復合體分子，還能夠以非腫瘤抗原限制性的方式殺傷腫瘤細胞，同時防止同種異體移植物排斥反應、移植物抗宿主反應，這為采用DNT細胞治療腫瘤開辟了一條新途徑。

傳統的DNT細胞培養方法大多依靠CD3抗體和CD28抗體等來模擬抗原呈遞過程刺激單個核細胞向DNT細胞轉化、增殖和活化，不具備抗原特異性。本發明將DNT細胞與DC細胞聯合培養，通過DC細胞以主要組織相容性抗原與腫瘤抗原復合體的形式呈遞抗原，特異性地促進了DNT細胞的增殖和活化。模擬了從特異辨別腫瘤細胞到消滅腫瘤細胞的全過程，即利用腫瘤細胞抗原來激活DC細胞，使其特異性地吞噬和呈遞多種腫瘤抗原，進一步刺激DNT細胞的增殖和活化，提升DNT細胞的殺瘤作用。

發明內容