[發明專利]一種檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法

在審

• 申請號: 202110254432.5
• 申請日: 2021-03-09
• 公開（公告）號: CN112980772A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 袁源;劉新光;鄭慧玲;崔紅晶;蔣智文
• 申請（專利權）人: 廣東醫科大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明屬于細胞生物學檢測技術領域，公開了一種檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，包括：制備葡萄籽提取物，加水稀釋獲得花青素溶液；將建模小鼠進行高脂飼料飼養28天；令小鼠空腹6小時后，抽取飼養后小鼠的尾靜脈血，測定血糖濃度；對糖尿病小鼠進行花青素溶液喂食28天；切取飼養后糖尿病小鼠的胰腺組織，使用組織固定劑進行固定；用石蠟包埋，作冠狀切片；使用試劑盒進行胰島β細胞凋亡情況的觀察。本發明使用葡萄籽提取物作為花青素來源進行小鼠胰島β細胞自噬效果檢測，檢測效果更好；糖尿病小鼠建模能夠實現對糖尿病病體組織的獲取，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒僅需進行切片的洗滌和染色，檢測效果展現更直觀。

技術領域

本發明屬于細胞生物學檢測技術領域，尤其涉及一種檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法。

背景技術

目前，自噬是細胞利用溶酶體降解已受損的大分子物質和細胞器的過程，自噬連續不斷清理錯誤折疊的蛋白質、有害的代謝產物、老化的線粒體等細胞器，從而保持胰島β細胞的正常狀態。研究表明，花青素具有很強的自由基清除和抗氧化活性能力，在預防心血管疾病、腫瘤、糖尿病中發揮著重要的作用。桑樹果實花色苷提取物素通過抗氧化應激抑制胰島β細胞凋亡，從而預防糖尿病。但是目前暫無檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，無法為糖尿病防治提供理論依據。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：目前暫無檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，無法為糖尿病防治提供理論依據。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法。

本發明是這樣實現的，一種檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法包括以下步驟：

步驟一，稱取原料葡萄籽，將葡萄籽洗凈后進行干燥；將干燥的葡萄籽粉碎，過80～120目篩，得到葡萄籽粉末。

步驟二，向葡萄籽粉末中加入粉末質量體積5～9倍量、溫度為100～110℃的熱水攪拌20～25min，過濾，得濾液A。

步驟三，將濾液A過大孔樹脂DM21吸附，并用水洗雜，得濾液B；所述大孔樹脂的加入量為所述濾液量的1.0～1.3倍。

步驟四，向濾液B中加入濃度為60％的乙醇，超聲提取得到葡萄籽提取液；將葡萄籽提取液進行真空干燥，得到葡萄籽提取物。

步驟五，將葡萄籽提取物直接過LSK11樹脂，收集流出液；將流出液用低溫等離子體氣氛處理葡萄籽提取物20～30min，得到純化的葡萄籽提取物。

步驟六，將純化的葡萄籽提取物減壓濃縮為婆美度為15～20的濃縮液，并進行噴霧，得產品葡萄籽提取物；加水稀釋獲得花青素溶液，作為檢測試劑。

步驟七，將建模小鼠進行高脂飼料飼養，飼養時間為28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取飼養后小鼠的尾靜脈血，測定血糖，血糖濃度高于16.7mmol/L的小鼠作為糖尿病小鼠模型。

步驟八，對糖尿病小鼠進行花青素溶液喂食，喂食時間為28～30天；切取飼養后糖尿病小鼠的胰腺組織，分離獲得小鼠胰島β細胞。

步驟九，將獲得的小鼠胰島β細胞接種于培養瓶中，預培養3～5天，得預培養體系；將所述預培養體系無菌注入材質為FEP的細胞培養袋中。

步驟十，將含10％胎牛血清的RPMI 1640培養液的細胞培養基注入培養基保存袋中；利用聯通管將所述細胞培養袋和培養基保存袋進行連接，所述聯通管上設置有可拆卸的三通止流閥。

步驟十一，將所述細胞培養袋置于培養箱中進行培養，所述培養箱內設置溫度為37℃，CO₂濃度為5％；將所述培養基保存袋置于4℃冰箱內培養小鼠胰島β細胞，利用流式細胞技術構建小鼠胰島β細胞凋亡模型。