[發(fā)明專利]一種檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110254432.5 | 申請日： | 2021-03-09 |
| 公開（公告）號： | CN112980772A | 公開（公告）日： | 2021-06-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 袁源;劉新光;鄭慧玲;崔紅晶;蔣智文 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣東醫(yī)科大學 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 重慶市信立達專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230 | 代理人： | 陳炳萍 |
| 地址： | 524000 *** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 檢測 花青素 誘導 小鼠 胰島 細胞 效果 方法 | ||
1.一種檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，其特征在于，所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法包括以下步驟：
步驟一，稱取原料葡萄籽，將葡萄籽洗凈后進行干燥；將干燥的葡萄籽粉碎，過80～120目篩，得到葡萄籽粉末；
步驟二，向葡萄籽粉末中加入粉末質(zhì)量體積5～9倍量、溫度為100～110℃的熱水攪拌20～25min，過濾，得濾液A；
步驟三，將濾液A過大孔樹脂DM21吸附，并用水洗雜，得濾液B；所述大孔樹脂的加入量為所述濾液量的1.0～1.3倍；
步驟四，向濾液B中加入濃度為60％的乙醇，超聲提取得到葡萄籽提取液；將葡萄籽提取液進行真空干燥，得到葡萄籽提取物；
步驟五，將葡萄籽提取物直接過LSK11樹脂，收集流出液；將流出液用低溫等離子體氣氛處理葡萄籽提取物20～30min，得到純化的葡萄籽提取物；
步驟六，將純化的葡萄籽提取物減壓濃縮為婆美度為15～20的濃縮液，并進行噴霧，得產(chǎn)品葡萄籽提取物；加水稀釋獲得花青素溶液，作為檢測試劑；
步驟七，將建模小鼠進行高脂飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)時間為28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取飼養(yǎng)后小鼠的尾靜脈血，測定血糖，血糖濃度高于16.7mmol/L的小鼠作為糖尿病小鼠模型；
步驟八，對糖尿病小鼠進行花青素溶液喂食，喂食時間為28～30天；切取飼養(yǎng)后糖尿病小鼠的胰腺組織，分離獲得小鼠胰島β細胞；
步驟九，將獲得的小鼠胰島β細胞接種于培養(yǎng)瓶中，預培養(yǎng)3～5天，得預培養(yǎng)體系；將所述預培養(yǎng)體系無菌注入材質(zhì)為FEP的細胞培養(yǎng)袋中；
步驟十，將含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)基注入培養(yǎng)基保存袋中；利用聯(lián)通管將所述細胞培養(yǎng)袋和培養(yǎng)基保存袋進行連接，所述聯(lián)通管上設(shè)置有可拆卸的三通止流閥；
步驟十一，將所述細胞培養(yǎng)袋置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置溫度為37℃，CO2濃度為5％；將所述培養(yǎng)基保存袋置于4℃冰箱內(nèi)培養(yǎng)小鼠胰島β細胞，利用流式細胞技術(shù)構(gòu)建小鼠胰島β細胞凋亡模型；
步驟十二，將培養(yǎng)后的小鼠胰島β細胞使用組織固定劑進行固定；用石蠟包埋，作冠狀切片；
步驟十三，使用碧云天生產(chǎn)的一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒作為檢測用試劑盒，并將已固定的冠狀切片使用二甲苯進行2次脫蠟；
步驟十四，依次用100％、95％、75％乙醇進行水化，水化共進行三次，每次1min；使用PBS緩沖液進行二次洗滌，后進行染色，并室溫孵育10min；使用PBS緩沖液進行三次洗滌，觀察試劑盒胰島β細胞凋亡情況的顯示結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，其特征在于，步驟四中，所述超聲提取中的超聲頻率為35～45Hz，超聲時間為30～40min，超聲提取溫度為40～50℃。
3.如權(quán)利要求1所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，其特征在于，步驟五中，所述用低溫等離子體氣氛處理葡萄籽提取物時，低溫等離子體氣氛為體積比為1～2:1的O2和N2。
4.如權(quán)利要求1所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，其特征在于，步驟六中，所述減壓濃縮的條件為-0.05～-0.1MPa，40～65℃；所述噴霧時的進口溫度為180～200℃，出口溫度為85～95℃。
5.如權(quán)利要求1所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，其特征在于，步驟七中，所述建模小鼠為3～5月齡的雄性SD小鼠，體重為200～240克。
6.如權(quán)利要求1所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，其特征在于，步驟七中，所述高脂飼料按照質(zhì)量份數(shù)由麩皮10～15份、玉米10～12份、豆粕8～15份、酪蛋白6～8份、麥芽糊精10～12份、大豆油3～6份、膽固醇1～2份組成。
7.如權(quán)利要求1所述檢測花青素誘導小鼠胰島β細胞自噬效果的方法，其特征在于，步驟八中，所述對糖尿病小鼠進行花青素溶液喂食時，花青素溶液攝入量為每天10ml。
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