[發(fā)明專(zhuān)利]一種質(zhì)控菌株定量小球的制備及使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110253964.7
• 申請(qǐng)日: 2021-03-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112980692B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡向榮;許英俊;李杜娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/04
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/04;C12N1/20;C12Q1/06;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京一格知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11316
• 代理人: 李魏英

本發(fā)明涉及微生物凍干球制備及使用技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種質(zhì)控菌株定量小球的制備及使用方法。制備方法包括如下步驟：(1)質(zhì)控菌株的單菌落挑至液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得菌液；(2)取定量菌液至凍干菌種保護(hù)劑中，并用保護(hù)劑稀釋得保護(hù)劑菌液；(3)取定量保護(hù)劑菌液，用液氮冷凍成球后進(jìn)行預(yù)凍；(4)將步驟(3)得到預(yù)凍小球進(jìn)行真空冷凍干燥，得干燥小球；(5)分裝。使用方法：將1ml無(wú)菌生理鹽水加入裝有凍干菌球的西林瓶，充分溶解混勻，即可得到含一定菌數(shù)的菌液，直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明制備得到的定量小球具有能夠滿足質(zhì)控樣品使用要求，制備方法簡(jiǎn)單，使用方便的有益效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物凍干球制備及使用技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種質(zhì)控菌株定量小球的制備及使用方法。

背景技術(shù)

實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)可靠性和有效性是檢驗(yàn)工作和科學(xué)研究的生命線。

利用微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)越來(lái)越受到重視，繼《中國(guó)藥典》要求進(jìn)行微生物檢驗(yàn)方法適用性試驗(yàn)后，保健食品和化妝品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作中也提出相關(guān)要求。利用標(biāo)準(zhǔn)菌種作為參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行藥品、保健食品和化妝品微生物檢驗(yàn)過(guò)程控制，是保障檢驗(yàn)結(jié)果科學(xué)準(zhǔn)確的重要環(huán)節(jié)，《中國(guó)藥典》、保健食品和化妝品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)等均有明確要求。

微生物檢驗(yàn)方法學(xué)適用性試驗(yàn)需要用到含有一定菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，傳統(tǒng)的梯度稀釋方法操作繁瑣，工作量較大。微生物定量質(zhì)控菌株是考查實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的重要工具，適用于食品、藥品微生物檢測(cè)的定量質(zhì)控菌株是制約微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的一個(gè)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種質(zhì)控菌株定量小球的制備及使用方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中菌液梯度稀釋方法操作繁瑣，工作量較大的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：包括如下步驟：

(1)質(zhì)控菌株的單菌落挑至液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得菌液；

(2)取定量菌液至凍干菌種保護(hù)劑中，并用保護(hù)劑稀釋得保護(hù)劑菌液；

(3)取定量保護(hù)劑菌液，用液氮定型成球后進(jìn)行預(yù)凍；

(4)將步驟(3)得到預(yù)凍小球進(jìn)行真空冷凍干燥，得干燥小球；

(5)分裝。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟(2)中，所述凍干菌種保護(hù)劑包括以下組分及其質(zhì)量配比：蛋白質(zhì)10％，水溶性糖5％，凍干塑形劑10％，余量為水。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，所述凍干菌種保護(hù)劑為蛋白質(zhì)、水溶性糖與凍干塑形劑全部溶解后，經(jīng)115℃高壓滅菌20分鐘，冷卻所得。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，所述蛋白質(zhì)為人血清白蛋白、小牛血清、脫脂奶粉中的至少一種；所述水溶性糖為蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的至少一種；所述凍干塑形劑為聚乙二醇4000、聚乙二醇8000及聚乙二醇20000、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一種。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟(3)中，液氮冷凍過(guò)程中使用液氮冷凍小球裝置，所述液氮冷凍小球裝置包括保溫容器，點(diǎn)樣針和冷凍多孔板，所述保溫容器內(nèi)容納液氮，所述冷凍多孔板置于所述保溫容器內(nèi)部，所述冷凍多孔板設(shè)有數(shù)個(gè)間隔板，所述間隔板縱橫交叉形成數(shù)個(gè)冷凍空間，每個(gè)冷凍空間底部設(shè)冷凍孔，所述點(diǎn)樣針置于所述保溫容器上方，所述點(diǎn)樣針底端距離液氮液面5-8cm，向所述冷凍孔滴菌液，待所有所述冷凍間隔空間均滴入一滴菌液，菌液冷凍成小球之后，再重復(fù)向所述冷凍空間滴加菌液的操作。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，所述步驟(2)中，吸取菌液50ul。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，所述步驟(2)中，菌液稀釋100倍。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，所述步驟(3)中，預(yù)凍條件為-35℃，2h。