[發(fā)明專利]一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110252835.6
• 申請日: 2021-03-09
• 公開（公告）號: CN113151342A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹鴻萍;劉永軍;樂龍;張健;貢艷;馮瑞茹;胡紹顯;邵青青
• 申請（專利權(quán)）人: 南京東萬生物技術(shù)有限公司;江蘇艾洛特醫(yī)藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12N15/12;C07K14/78;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/36;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，其特征在于，包括以下步驟；

(1)制備質(zhì)粒：優(yōu)選人源蛋白中的II型和III型膠原蛋白基因螺旋區(qū)的DNA片段，利用PCR技術(shù)將DNA片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化和拼接重組，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位點(diǎn)，加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將基因片段切成粘性末端，并與相應(yīng)酶切處理過的pET32a的表達(dá)載體共孵育，加入T4 DNA連接酶，4℃連接12小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，命名為為pET32a-NTOD；

(2)轉(zhuǎn)化：將步驟(1)制備的質(zhì)粒與畢赤酵母進(jìn)行混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化后菌落；

(3)多拷貝插入重組子的篩選：將步驟(2)轉(zhuǎn)化后的菌落進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子；

(4)發(fā)酵：將步驟(3)篩選的轉(zhuǎn)化子接種后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；

(5)純化：將步驟(4)得到的發(fā)酵液依次進(jìn)行固液分離、過濾、濃縮和離子交換層析得到產(chǎn)品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，其特征在于，所述純化包括以下步驟；

(1)粗分離

將人源化膠原蛋白蛋白用沉降式離心機(jī)進(jìn)行固液分離，所得上清液用0.2μm中空纖維膜進(jìn)行過濾，濾出液用截留分子量為4.5-6K的超濾膜進(jìn)行超濾；

(2)精細(xì)分離純化

向步驟(1)超濾后的濃縮液中加入檸檬酸，調(diào)節(jié)濃縮液的電導(dǎo)率為2.05～5.85mS/cm，再用NaOH調(diào)節(jié)pH至4.52～6.15，然后通過弱陽離子交換層析柱純化，純化時(shí)先用流動相A洗脫，再用流動相A與流動相B體積比為90∶5的混合液洗脫，最后用流動相A與流動相B體積比為90∶10～75∶30的混合液洗脫，洗脫流速均為130～260L/min；收集流動相A與流動相B體積比為90∶10～75∶30時(shí)的洗脫液，得到純度大于98％的人源化膠原蛋白蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述截留分子量為4.5-6K的超濾膜為中空纖維超濾膜，且超濾過程中控制超濾膜壓力不高于0.1MPa。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述弱陽離子交換層析柱的填料為高流速瓊脂糖弱陽離子交換填料，填料總離子交換量不低于0.045-0.06mmol/mL，線性流速不得高于7.5-10mL/cm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，其特征在于，步驟(2)中的轉(zhuǎn)化；將經(jīng)過篩分后得到的正確pET32a-NTOD質(zhì)粒用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選出單斑克隆，并且在5mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按照1∶100轉(zhuǎn)接，在搖瓶中36.5～37.2℃之間培養(yǎng)至等電點(diǎn)為0.5～0.7之間，加入冰預(yù)冷的與畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻，涂布在培養(yǎng)基板上，培養(yǎng)2.5～3.5天，長處菌落。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，其特征在于，步驟(3)和(4)中的篩選以及發(fā)酵；將培養(yǎng)完成后的菌落采用無菌轉(zhuǎn)移針轉(zhuǎn)移至G418濃度分別為0.45g/L、1.5g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.5g/L、5.5g/L的YPD平板上培養(yǎng)，篩選后獲得轉(zhuǎn)化子，將篩選獲得的轉(zhuǎn)化子接種于培養(yǎng)基中，對培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將震蕩后的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于FBS培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，將pH值調(diào)節(jié)至5～7之間，培養(yǎng)20～24小時(shí)，將培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接入FBS培養(yǎng)基的大罐發(fā)酵，生長溫度控制在28～30℃。