[發(fā)明專利]一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110252835.6
• 申請(qǐng)日: 2021-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN113151342A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹鴻萍;劉永軍;樂龍;張健;貢艷;馮瑞茹;胡紹顯;邵青青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京東萬生物技術(shù)有限公司;江蘇艾洛特醫(yī)藥研究院有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/66;C12N15/12;C07K14/78;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/36;C12R1/84
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本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，包括以下步驟；(1)制備質(zhì)粒：優(yōu)選人源蛋白中的II型和III型膠原蛋白基因螺旋區(qū)的DNA片段，利用PCR技術(shù)將DNA片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化和拼接重組，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位點(diǎn)，加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將基因片段切成粘性末端，并與相應(yīng)酶切處理過的pET32a的表達(dá)載體共孵育，(2)轉(zhuǎn)化：將步驟(1)制備的質(zhì)粒與畢赤酵母進(jìn)行混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化后菌落；(3)多拷貝插入重組子的篩選：將步驟(2)轉(zhuǎn)化后的菌落進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子；(4)發(fā)酵：將步驟(3)篩選的轉(zhuǎn)化子接種后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；(5)純化：將步驟(4)得到的發(fā)酵液依次進(jìn)行固液分離、過濾、濃縮和離子交換層析得到產(chǎn)品。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法。

背景技術(shù)

膠原蛋白(collagen)是體內(nèi)含量最多的一種蛋白質(zhì)，約占蛋白質(zhì)總量的 25％-33％，廣泛地存在于人體的骨、腱、軟骨和皮膚及其它結(jié)締組織中，是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分，其對(duì)維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復(fù)有重要作用。在分子結(jié)構(gòu)上，膠原蛋白是由平行線型鏈組成，每一線型鏈由三條扭曲左旋的α-肽鏈通過鏈間相互作用緊密結(jié)合而形成的一極強(qiáng)的右旋三重螺旋結(jié)構(gòu)。每條α-肽鏈由多達(dá)300個(gè)以上的Gly-X-Y三聯(lián)體重復(fù)構(gòu)成，兩端連接具有不同結(jié)構(gòu)的其它小片段。組成膠原蛋白的氨基酸殘基均為α-氨基酸，其中X、Y是Gly之外的任何氨基酸殘基。

膠原蛋白作為天然的生物資源，具有合成高分子材料無法比擬的生物相容性和生物可降解性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品和化妝品行業(yè)中。在現(xiàn)有技術(shù)中，生產(chǎn)膠原蛋白傳統(tǒng)的也是最主要的方法是利用酸、堿法處理動(dòng)物來源的組織(豬皮、牛皮、驢皮、魚等)，從中提取膠原蛋白；另外，還有酶法提取膠原蛋白；雖然這些方法具有較高的回收率，但是這些方法制取的膠原蛋白均為長(zhǎng)度不等的混合膠原蛋白肽段，各肽段水溶性不一，難以分離到單獨(dú)的肽段純品，同時(shí)由于均為異源性膠原蛋白，在臨床上表達(dá)出排異反應(yīng)，使其作為生物醫(yī)學(xué)材料或藥物載體等方面的應(yīng)用受到了很大限制。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因重組技術(shù)，可以在動(dòng)物、植物和微生物表達(dá)體系獲得重組人膠原蛋白，解決了傳統(tǒng)提取方法存在的病毒隱患等缺點(diǎn)，同時(shí)也改善了膠原蛋白的親水性、免疫排異性等。國(guó)內(nèi)外一些研究機(jī)構(gòu)及生物公司相繼投入研究開發(fā)重組膠原蛋白，楊霞等在2012 年通過重復(fù)III型膠原肽段并與II型膠原肽段融合在大腸桿菌中獲得高表達(dá)；我國(guó)西北大學(xué)的范代娣等利用大腸桿菌通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)類人膠原蛋白，得到高表達(dá)的類人膠原，并以此為原材料開發(fā)組織工程材料和化妝品，但其設(shè)計(jì)的部分氨基酸序列并非人源膠原蛋白序列，同時(shí)，細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)生的致熱源使表達(dá)產(chǎn)物難以應(yīng)用于臨床，而且目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，致使產(chǎn)物純化困難，另外原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾加工體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低等缺點(diǎn)影響產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，在制備人源膠原蛋白的技術(shù)領(lǐng)域，亟需開發(fā)一種純度高、安全性高、親水性強(qiáng)、生物相容性好的人源膠原蛋白，并且可以實(shí)現(xiàn)不在細(xì)菌上進(jìn)行表達(dá)的方法。

發(fā)明內(nèi)容

(一)解決的技術(shù)問題

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種純度高，安全性好的人源化膠原蛋白制備工藝和方法。

(二)技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種人源化膠原蛋白制備工藝和方法，包括以下步驟；

(1)制備質(zhì)粒：優(yōu)選人源蛋白中的II型和III型膠原蛋白基因螺旋區(qū)的 DNA片段，利用PCR技術(shù)將DNA片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化和拼接重組，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位點(diǎn)，加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將基因片段切成粘性末端，并與相應(yīng)酶切處理過的pET32a的表達(dá)載體共孵育，加入T4 DNA 連接酶，4℃連接12小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；用氨芐青霉素鈉-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，命名為為 pET32a-NTOD；