[發(fā)明專利]一種乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110252787.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113075405A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王勝嵐;馬玉蘭;黃永宏;李梅;許玉燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山生物工程有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/576
• 分類號(hào): G01N33/576;G01N33/577;G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 尹凡華

1.一種乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：包被有HBsAg單克隆抗體的包被板、底物液、酶標(biāo)HBsAg多克隆抗體溶液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、濃縮洗滌液和終止液；所述包被板中采用包被緩沖液對(duì)HBsAg單克隆抗體進(jìn)行稀釋，所述HBsAg單克隆抗體與包被緩沖液的體積比為1：(1500-2500)；

所述酶標(biāo)HBsAg多克隆抗體溶液中采用酶標(biāo)稀釋液對(duì)酶標(biāo)HBsAg多克隆抗體進(jìn)行稀釋，所述酶標(biāo)HBsAg多克隆抗體與酶標(biāo)稀釋液的體積比為1：(800-1200)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)HBsAg多克隆抗體為采用碘酸鈉-乙二醇法對(duì)HBsAg多克隆抗體進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述包被緩沖液為10mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH＝7.9-8.1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)稀釋液包括以下重量份的組分：

所述酶標(biāo)稀釋液的pH＝7.3-7.5。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為含20％NaCl、0.5％KCl和3.0％Tween-20的0.25mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝6.0-6.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述終止液為1mol/L的H₂SO₄溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述底物液包括底物A液和底物B液；所述底物A液為含0.6g/L過(guò)氧化脲的10mmol/L檸檬酸-醋酸鈉緩沖液；所述底物B液為含0.042％TMB、0.3％丙酮、4％無(wú)水乙醇、0.3g/L EDTA-Na₂、3％甘油的10mmol/L檸檬酸溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照為采用陰性對(duì)照稀釋液進(jìn)行稀釋后的陰性對(duì)照血清，所述陰性對(duì)照稀釋液為含小牛血清、甘油、疊氮鈉和果綠的磷酸鹽緩沖溶液，所述陰性對(duì)照的吸光值≤0.1；

所述陽(yáng)性對(duì)照為采用陽(yáng)性對(duì)照稀釋液進(jìn)行稀釋后的陽(yáng)性對(duì)照血清，所述陽(yáng)性對(duì)照稀釋液為含小牛血清、甘油、ProClin300和胭脂紅的磷酸鹽緩沖溶液，所述陽(yáng)性對(duì)照的吸光值≥0.8。

9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)包被：將HBsAg單克隆抗體用包被緩沖液稀釋后，按95-105μL/孔的用量添加至微孔板的孔內(nèi)，于18-26℃吸附20-30h，扣干；

(2)封閉：用含0.25％酪蛋白、5％蔗糖、2％液體明膠、0.02％NaN₃的10mmol/L、pH為7.3-7.5的磷酸鹽緩沖液作為封閉液，以140-160μL/孔的用量添加至微孔板的孔內(nèi)，于18-26℃封閉16-26h；

(3)干燥及封板：棄去封閉液，經(jīng)干燥處理后密封，制得包被有HBsAg單克隆抗體的包被板；

(4)配置并分裝底物液、酶標(biāo)HBsAg多克隆抗體溶液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、濃縮洗滌液和終止液，經(jīng)組裝，得到乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒。

10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的乙肝病毒表面抗原檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、配置洗滌液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水作1：25稀釋；

S2、取出包被板，加入待測(cè)樣品50μL/孔，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照各2孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入相應(yīng)對(duì)照血清50μL，空白對(duì)照孔加入100μL洗滌液，混勻；覆蓋封板膠后，置37℃避光溫育30min；

S3、不洗板，直接每孔內(nèi)加入50μL酶標(biāo)HBsAg多克隆抗體溶液，混勻，覆封板膠后，置37℃避光溫育30min；

S4、洗板：用洗滌液洗板5次，每次靜置1min，扣干；

S5、顯色和終止：加底物液，于37℃避光顯色10min后，加入終止液50μL/孔；

S6、測(cè)定：用酶標(biāo)儀450mm或450nm/630nm以空白對(duì)照孔校零，測(cè)各孔吸光值；

S7、結(jié)果分析與判定：臨界值cut-off＝2.1×陰性對(duì)照的平均吸光值，當(dāng)陰性對(duì)照的平均吸光值＜0.05時(shí)，按0.05計(jì)算；當(dāng)待測(cè)樣品的吸光值＜Cut-off，判斷為陰性；當(dāng)待測(cè)樣品吸光值≥Cut-off，判斷為陽(yáng)性。