[發(fā)明專利]一種鑒定人生長(zhǎng)激素蛋白質(zhì)存在形式生物標(biāo)志物譜的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110252781.3
• 申請(qǐng)日: 2021-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN112881500A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 詹顯全;李彪;王小偉;李娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）
• 主分類號(hào): G01N27/447
• 分類號(hào): G01N27/447;G01N30/02;G01N30/72;G01N33/68
• 代理公司: 西安匯恩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61244
• 代理人: 張偉花

本發(fā)明提供了一種鑒定人生長(zhǎng)激素蛋白質(zhì)存在形式生物標(biāo)志物譜的方法，該方法為：收集人生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤和正常垂體組織樣本，分別提取組織蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向凝膠電泳、蛋白印跡、考馬斯亮藍(lán)染色，將可視化PVDF膜和雙向凝膠掃描到數(shù)字化圖像中，相對(duì)應(yīng)的雙向凝膠蛋白點(diǎn)用胰蛋白酶消化后純化，經(jīng)質(zhì)譜鑒定、生物信息學(xué)分析，鑒定GHP生物標(biāo)志物譜；用定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)和乙酰化蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)合生物信息學(xué)鑒定GHP上的翻譯后修飾及剪切變異。本發(fā)明可鑒定生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤與正常垂體組織間GHP變化模式，46種GHPs在生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤中被鑒定，35種在正常垂體組織中被鑒定，11種僅在生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤組織中出現(xiàn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定人生長(zhǎng)激素蛋白質(zhì)存在形式生物標(biāo)志物譜的方法。

背景技術(shù)

垂體腺瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤之一，患病率占全球的17％。垂體腺瘤分泌異常的生長(zhǎng)激素(Growth hormone；GH)可致臨床疾病，在兒童時(shí)期，過量的GH分泌導(dǎo)致異常大的骨骼形成巨人癥，然而GH分泌不足導(dǎo)致侏儒癥；在成人中，由垂體腺瘤引起的GH分泌過多導(dǎo)致肢端肥大癥。垂體腺瘤導(dǎo)致一些GH相關(guān)疾病長(zhǎng)期影響人類的健康。盡管目前有藥物治療以及手術(shù)切除等多種治療手段和方式，但垂體腺瘤導(dǎo)致的一系列GH相關(guān)疾病在臨床治療效果上仍然不理想。因此，尋找垂體腺瘤的生長(zhǎng)激素蛋白質(zhì)存在形式(Growth hormoneproteoform；GHP)生物標(biāo)志物和相關(guān)生長(zhǎng)激素疾病的GHP生物標(biāo)志物是治療垂體腺瘤和生長(zhǎng)激素相關(guān)疾病的關(guān)鍵手段之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒定人生長(zhǎng)激素蛋白質(zhì)存在形式生物標(biāo)志物譜的方法，該方法可鑒定生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤與正常垂體組織之間GHPs的變化模式，46種GHPs在生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤中被鑒定，35種GHPs在正常垂體組織中被鑒定；其中11種GHPs僅在生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤組織中出現(xiàn)，而正常垂體組織中沒有出現(xiàn)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種鑒定人生長(zhǎng)激素蛋白質(zhì)存在形式生物標(biāo)志物譜的方法，該方法為：

S1、收集人生長(zhǎng)激素分泌型垂體腺瘤和正常垂體組織樣本，分別裂解組織并提取兩組組織蛋白質(zhì)；

S2、將S1中得到的每組組織蛋白質(zhì)均分成兩份，分別進(jìn)行雙向凝膠電泳，得到含有蛋白質(zhì)的雙向凝膠，均命名為含有蛋白質(zhì)的雙向凝膠a和含有蛋白質(zhì)的雙向凝膠b；

S3、將S2中得到的含有蛋白質(zhì)的雙向凝膠a進(jìn)行蛋白印跡，得到可視化PVDF膜；

S4、將S2中得到的含有蛋白質(zhì)的雙向凝膠b浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中，得到用考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠b；將S3中進(jìn)行完蛋白印跡后的含有蛋白質(zhì)的雙向凝膠a浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中，得到用考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠a；

S5、將S3中得到的可視化PVDF膜、S4中得到的考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠b和用考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠a掃描到數(shù)字化圖像中，將所述數(shù)字化圖像導(dǎo)入到Bio-RadPDQuest雙向凝膠圖像分析軟件中定量蛋白質(zhì)點(diǎn)的體積，將呈免疫陽(yáng)性的蛋白印跡點(diǎn)與相應(yīng)的用考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠a和用考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠b的蛋白質(zhì)點(diǎn)相匹配；

S6、將S4中得到的用考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠a和用考馬斯亮藍(lán)染色的雙向凝膠b中的凝膠點(diǎn)中與S3中所述可視化PVDF膜中呈免疫陽(yáng)性的蛋白印跡點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的雙向凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)，用胰蛋白酶酶解所述雙向凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)中的蛋白質(zhì)，抽提胰蛋白酶酶解肽混合物，然后用ZipTipC₁₈微柱進(jìn)行純化，得到純化后的胰蛋白酶酶解肽混合物；

S7、將S6中得到的純化后的胰蛋白酶肽混合物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析、LC-ESI-MS/MS分析或著MALDI-TOF-TOF-MS/MS分析，得到質(zhì)譜圖；