[發明專利]一種鑒定人生長激素蛋白質存在形式生物標志物譜的方法

在審

• 申請號: 202110252781.3
• 申請日: 2021-03-09
• 公開（公告）號: CN112881500A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 詹顯全;李彪;王小偉;李娜
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N30/02;G01N30/72;G01N33/68
• 代理公司: 西安匯恩知識產權代理事務所(普通合伙) 61244
• 代理人: 張偉花

1.一種鑒定人生長激素蛋白質存在形式生物標志物譜的方法，其特征在于，該方法為：

S1、收集人生長激素分泌型垂體腺瘤和正常垂體組織樣本，分別裂解組織并提取兩組組織蛋白質；

S2、將S1中得到的每組組織蛋白質均分成兩份，分別進行雙向凝膠電泳，得到含有蛋白質的雙向凝膠，均命名為含有蛋白質的雙向凝膠a和含有蛋白質的雙向凝膠b；

S3、將S2中得到的含有蛋白質的雙向凝膠a進行蛋白印跡，得到可視化PVDF膜；

S4、將S2中得到的含有蛋白質的雙向凝膠b浸泡在考馬斯亮藍染色液中，得到用考馬斯亮藍染色的雙向凝膠b；將S3中進行完蛋白印跡后的含有蛋白質的雙向凝膠a浸泡在考馬斯亮藍染色液中，得到用考馬斯亮藍染色的雙向凝膠a；

S5、將S3中得到的可視化PVDF膜、S4中得到的考馬斯亮藍染色的雙向凝膠b和用考馬斯亮藍染色的雙向凝膠a掃描到數字化圖像中，將所述數字化圖像導入到Bio-Rad PDQuest雙向凝膠圖像分析軟件中定量蛋白質點的體積，將呈免疫陽性的蛋白印跡點與相應的用考馬斯亮藍染色的雙向凝膠a和用考馬斯亮藍染色的雙向凝膠b的蛋白質點相匹配；

S6、將S4中得到的用考馬斯亮藍染色的雙向凝膠a和用考馬斯亮藍染色的雙向凝膠b中的凝膠點中與S3中所述可視化PVDF膜中呈免疫陽性的蛋白印跡點相對應的雙向凝膠蛋白質點，用胰蛋白酶酶解所述雙向凝膠蛋白質點中的蛋白質，抽提胰蛋白酶酶解肽混合物，然后用ZipTipC₁₈微柱進行純化，得到純化后的胰蛋白酶酶解肽混合物；

S7、將S6中得到的純化后的胰蛋白酶酶解肽混合物進行MALDI-TOF-MS分析、LC-ESI-MS/MS分析或者MALDI-TOF-TOF-MS/MS分析，得到質譜圖；

S8、將S7中得到的質譜圖的PMF數據和MS/MS數據輸入Mascot搜索引擎中，并在UniProt數據庫搜索蛋白質進行鑒定；

S9、采用肽質量工具計算GH受胰蛋白酶酶解后的理論肽質量，與GH前體、成熟GH、及GH剪接變異體1、2、3和4的理論序列比對，確定GH前體和成熟GH以及GH剪接變異體1、2、3和4的特征性胰蛋白酶酶解肽；將得到的所述特征性胰蛋白酶酶解肽與S7中得到的每張質譜圖進行比對，確定每個GHP是否源于GH前體和成熟GH以及GH剪接變異體1、2、3和4；所述GH前體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述成熟GH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述GH剪接變異體1序列如SEQ ID NO:3所示，所述GH剪接變異體2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述GH剪接變異體3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述GH剪接變異體4的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

S10、對生長激素分泌型垂體腺瘤和正常垂體組織進行定量磷酸化蛋白組學，將兩種組織的蛋白質分別進行胰蛋白酶酶解，通過iTRAQ試劑標記胰蛋白酶肽混合物、用TiO₂富集磷酸化肽，用LC-MS/MS分析鑒定磷酸蛋白質的氨基酸序列和磷酸化位點，并量化每個磷酸肽的豐度；將獲得的GH磷酸化位點所在的胰蛋白酶肽與S7中獲得的每張質譜圖進行比對，以確定GHP的磷酸化狀態；

S11、對生長激素分泌型垂體腺瘤和正常垂體組織進行定量泛素化蛋白組學，將兩種組織的蛋白質分別進行胰蛋白酶酶解，從得到的胰蛋白酶肽混合物中用泛素抗體富集泛素化肽，用LC-MS/MS分析鑒定泛素化蛋白質的氨基酸序列和泛素化位點，并用無標簽定量方法定量泛素化肽的豐度；將獲得的GH泛素化位點所在的胰蛋白酶肽與S7中獲得的每張質譜圖進行比對，以確定GHP的泛素化狀態；

S12、對生長激素分泌型垂體腺瘤和正常垂體組織進行定量乙酰化蛋白組學，將兩種組織的蛋白質分別進行胰蛋白酶酶解，從得到的胰蛋白酶肽混合物中用乙酰抗體富集乙酰化肽，用LC-MS/MS分析鑒定乙酰化蛋白質的氨基酸序列和乙酰化位點，并用無標簽定量方法定量乙酰化肽的豐度；將獲得的GH乙酰化位點所在的胰蛋白酶肽與S7中獲得的每張質譜圖進行比對，以確定GHP的乙酰化狀態。