[發明專利]一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1

在審

• 申請號: 202110251766.7
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN112946286A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 任文潔;王亞芳;何保山;金華麗;衛敏;索志光
• 申請（專利權）人: 河南工業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/532
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1的制備方法其特征在于，包括以下步驟：

（1）親和素化柱狀納米金材料的制備：先將 0.3-0.4 g 0.2 mol/L 的季銨鹽類化合物與0.001 mol/L 5.00 mL的氯金酸水溶液室溫下充分混合，加入0.01 mol/L 0.90 mL的堿性溶液，反應5 min，生成種子，然后將0.3 g 0.2 mol/L氯化季銨鹽加入0.04 mol/L 0.10m的鹽溶液與0.001 mol/L 1-10 mL的氯金酸混合液，再加入濃度為 0.0788 mol/L 0.10mL的抗壞血酸水溶液，然后將得到的0.01-0.05 ml的種子液加入該溶液反應1-5 min，室溫下恒溫靜置24 h后以14000 r/min 的轉速離心，然后將6 ml親和素(1-5×10^-8 M)加入得到的溶液以12000 r/min轉速離心10分鐘三次，然后每次將沉淀物懸浮在含有0.1% PEG的季銨鹽中；并將其保持在0-10℃用于進一步使用；

（2）生物素化抗AFB₁單克隆抗體的制備：①配制pH 9.2、0.1 mol/L緩沖液1、pH 7.2、0.05 mol/L緩沖液2；②用二甲基甲酰胺將生物素配制成 38 mg/ml 溶液;用pH 9.2、0.1mol/L緩沖液1將純化單克隆抗體稀釋為 6.0 mg/ml, 裝入透析袋中對緩沖液1透析；③按生物素:單克隆抗體的質量比為 1∶10 室溫攪拌下混合反應1-10 h；④在反應混合液中加入48 μl、1 mol/L的NH₄Cl,孵育后將反應混合物裝入透析袋, 0-20 ℃下對緩沖液2透析過夜；

（3）基于生物素-親和素系統金標探針的制備：利用生物素和親和素之間高特異性親和力以及多級放大效應，可提高免疫結合和示蹤分析的靈敏度；生物素與親和素之間的結合力可達1015 mol L^-1,且兩者結合快速，耐受性強；

(4) 基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1：首先進行免疫層析試紙條的制備：通過將親和素與柱狀納米金共價結合作為標記探針，采用共價偶聯的方式連接生物素與抗黃曲霉毒B1單克隆抗體結合的聚合物形成偶聯物然后噴到玻璃纖維素膜上，將抗原1與抗原2和羊抗鼠 IgG 分別包被硝酸纖維素膜的T線（有兩條T線——T1和T2）和C線上；當奶粉中待測物的含量低于0.05 μg/kg, NC膜上出現三條紅色條帶（T1、T2和C線）；當奶粉中AFB1濃度高于0.05 μg/kg低于0.5 μg/kg，NC膜上出現兩條紅色條帶（T1和C線）；當奶粉中AFB1的含量大于0.5 μg/kg，NC膜上出現一條紅色條帶（C線）。

2.根據權利要求書1所述的一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1的制備步驟（1）所述的季銨鹽類化合物是四丁基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、氯化十二烷基二甲基芐基銨、溴化雙十八烷基二甲基銨、十八烷基二甲基羥乙基銨硝酸鹽的一種或多種；所述的堿性溶液是氫氧化鈉溶液、氫氧化鈣溶液、氫化鋰鋁溶液、硼氫化鈉溶液的一種或幾種；所述的鹽溶液是氯化鈉溶液、硝酸鈣溶液、硝酸銀溶液、硝酸鈉溶液的一種或幾種。

3.根據權利要求書1所述的一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1的制備步驟（2）緩沖液1、2是醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液中的一種或多種。