[發明專利]一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1

在審

• 申請號: 202110251766.7
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN112946286A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 任文潔;王亞芳;何保山;金華麗;衛敏;索志光
• 申請（專利權）人: 河南工業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/532
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及了.一種基于生物素?親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1的制備方法，包括以下步驟：通過將親和素與柱狀納米金共價結合作為標記探針，采用共價偶聯的方式連接生物素與抗黃曲霉毒B1納米抗體結合的聚合物形成偶聯物然后噴到玻璃纖維素膜上，將抗原1與抗原2和羊抗鼠IgG分別包被硝酸纖維素膜的T線（有兩條T線——T1和T2）和C線上，根據試紙條上檢測線和質控線的顯色情況半定量檢測奶粉中的黃曲霉毒素B1,具有簡便，快速，靈敏度高的特點，克服了目前檢測方法存在的操作繁瑣，檢測時間長的缺點，有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1的的制備方法。

背景技術

黃曲霉毒素是真菌毒素的一種，是目前已知的最強的三大化學致癌物之一，目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有理化檢測法和快檢免疫檢測法，理化檢測主要有 HPLC、HPLC-MS、TLC等，檢測靈敏度高，比較普及且成熟，檢測成本高; 快檢免疫檢測法主要有ELISA法、膠體金免疫層析法和量子點熒光免疫層析法等，操作簡便，省時省力，成本較低，結果直觀且適用于現場篩查。免疫層析法是近年來用于快速檢驗及診斷的新技術，快檢主要優勢在于其技術簡單，操作簡便，用時較少，省時省力，節省檢測成本，相對HPLC 法等方法來說，儀器設備要求較少，價格低廉，檢測結果直觀，可用于現場檢測。

發明內容

發明本發明涉及一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1的制備方法。

一種基于生物素-親和素系統雙檢測線免疫層析試紙條半定量檢測黃曲霉毒素B1的的制備方法，其步驟如下：

所述的的親和素化柱狀納米金材料的制備：先將 0.3-0.4 g 0.2 mol/L 的季銨鹽類化合物與0.001 mol/L 5.00 mL的氯金酸水溶液室溫下充分混合，加入0.01 mol/L0.90 mL的堿性溶液，反應5 min，生成種子，然后將0.3 g 0.2 mol/L氯化季銨鹽加入0.04mol/L 0.10 m的鹽溶液與0.001 mol/L 1-10 mL的氯金酸混合液，再加入濃度為 0.0788mol/L 0.10 mL的抗壞血酸水溶液，然后將得到的0.01-0.05 ml的種子液加入該溶液反應1-5 min，室溫下恒溫靜置24 h后以14000 r/min 的轉速離心，然后將6 ml親和素(1-5×10^-8M)加入得到的溶液以12000r/min轉速離心10分鐘三次，然后每次將沉淀物懸浮在含有0.1%PEG的季銨鹽中。并將其保持在0-10℃用于進一步使用。

所述的生物素化抗AFB₁單克隆抗體的制備：①配制pH 9.2、0.1 mol/L緩沖液1、pH7.2、0.05 mol/L緩沖液2。②用 二甲基甲酰胺將生物素配制成 38 mg/ml 溶液;用pH 9.2、0.1 mol/L緩沖液1將純化單克隆抗體稀釋為 6.0 mg/ml, 裝入透析袋中對緩沖液1透析。③按生物素: 單克隆抗體的質量比為 1∶10 室溫攪拌下混合反應1-10 h。④在反應混合液中加入48 μl、1 mol/L的NH₄Cl,孵育后將反應混合物裝入透析袋, 0-20 ℃下對緩沖液2透析過夜。

所述的基于生物素-親和素系統金標探針的制備：利用生物素和親和素之間高特異性親和力以及多級放大效應，可提高免疫結合和示蹤分析的靈敏度。生物素與親和素之間的結合力可達1015mol L^-1,且兩者結合快速，耐受性強。

所述的免疫層析試紙條的制備：通過將親和素與柱狀納米金共價結合作為標記探針，采用共價偶聯的方式連接生物素與抗黃曲霉毒B1單克隆抗體結合的聚合物形成偶聯物然后噴到玻璃纖維素膜上，將抗原1與抗原2和羊抗鼠 IgG 分別包被硝酸纖維素膜的T線（有兩條T線——T1和T2）和C線上。

所述的季銨鹽類化合物是四丁基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、氯化十二烷基二甲基芐基銨、溴化雙十八烷基二甲基銨、十八烷基二甲基羥乙基銨硝酸鹽的一種或多種。