[發(fā)明專利]一種評估NK細(xì)胞抗巨細(xì)胞病毒作用的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110251612.8
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN113109570B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃曉軍;趙翔宇;商倩楠;余星星
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京潤澤恒知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11319
• 代理人: 茍冬梅

1.一種檢測NK細(xì)胞抗巨細(xì)胞病毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括：

檢測NK細(xì)胞的抗巨細(xì)胞病毒的功能，包括：

以1×10⁵ 每孔的劑量，將MRC-5種入24孔板1號，放入37度孵箱1號培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，以MOI=2加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)；加入1000IU/ml預(yù)刺激過夜的NK細(xì)胞，同時加入Golgi plug試劑和CD107a抗體，37度孵箱1號培養(yǎng)4h后收集細(xì)胞；標(biāo)記所收集的細(xì)胞表面抗體CD3和CD56，固定破膜后標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)因子IFN-r，使用流式分析儀檢測CD107a的百分比和IFN-r分泌量；

檢測NK細(xì)胞抑制巨細(xì)胞病毒擴增的功能，包括：

將AD169感染的MRC-5細(xì)胞種入24孔板2號中，并加入1000IU/ml IL-2預(yù)刺激的NK細(xì)胞，將AD169感染的MRC-5細(xì)胞與1000IU/ml IL-2預(yù)刺激的NK細(xì)胞，放入37度孵箱2號中共培養(yǎng)，分別在第一天，第五天收集培養(yǎng)上清，使用巨細(xì)胞病毒檢測試劑盒和qPCR儀器檢測上清液中的CMV-DNA拷貝數(shù)；

檢測被NK細(xì)胞作用后的巨細(xì)胞病毒的再感染力，包括：

收集在所述檢測NK細(xì)胞抑制巨細(xì)胞病毒擴增的功能中所述第五天的培養(yǎng)上清，并將所述培養(yǎng)上清加入已有預(yù)先培養(yǎng)貼壁有MRC-5的24孔板3號中，于37度孵箱3號中培養(yǎng)1小時后更換新鮮培養(yǎng)基；將更換培養(yǎng)基后的24孔板3號置于37度孵箱3號培養(yǎng)5 天后收集上清液，使用巨細(xì)胞病毒檢測試劑盒和qPCR儀器檢測該上清液中的CMV-DNA拷貝數(shù)；通過0.05% 胰蛋白酶消化通過所述孵箱培養(yǎng)5 天后的MRC-5，使用巨細(xì)胞病毒檢測試劑盒和qPCR儀器檢測MRC-5內(nèi)CMV-DNA拷貝數(shù)；

檢測NK細(xì)胞對巨細(xì)胞病毒的清除功能，包括：

對6-8周雌性NSG小鼠，以X線亞致死劑量進行照射后，通過尾靜脈回輸HCMV血清陽性的G-CSF動員的供者外周血干細(xì)胞1×10⁶ /只；2周后，向回輸所述外周血干細(xì)胞的NSG小鼠，腹腔注射AD169感染的MRC-5細(xì)胞；移植后4周，過繼性回輸NK細(xì)胞1×10⁷ /只，并從回輸NK細(xì)胞開始隔天腹腔注射50000個單位IL-2；回輸NK細(xì)胞后第0天，第7天，第14天取小鼠肝，脾，肺，使用流式細(xì)胞分析儀檢測NK細(xì)胞的比例，基于原位雜交法，使用HCMV DNA探針檢測組織中CMV感染和清除情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述檢測NK細(xì)胞的抗巨細(xì)胞病毒的功能中，所述NK細(xì)胞與所述MRC-5的效靶比為1~10:1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述檢測NK細(xì)胞抑制巨細(xì)胞病毒擴增的功能中，所述NK細(xì)胞與所述AD169感染的MRC-5細(xì)胞的效靶比為1~10:1；

所述AD169感染的MRC-5細(xì)胞的培養(yǎng)過程為：向含有MRC-5培養(yǎng)基中，以MOI=0.5加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述檢測NK細(xì)胞對巨細(xì)胞病毒的清除功能中，腹腔注射AD169感染的MRC-5細(xì)胞的數(shù)量為1×10⁶ /只。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于，所述NK細(xì)胞為原代NK細(xì)胞或體外擴增的NK細(xì)胞。