[發明專利]生成雙鏈銜接物的方法

在審

• 申請號: 202110251569.5
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN113279067A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 約瑟夫·鄧納姆
• 申請（專利權）人: 賽科恩斯生物科學公司;南加利福尼亞大學
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C40B50/06;C12P19/34
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 韋昌金;鄭霞

本申請涉及樣品制備方法。本公開內容提供了制備用于測序的核酸樣品的單擴增法和雙擴增法。

本申請是申請日為2015年09月24日，申請號為 201580063859.X，發明名稱為“樣品制備方法”的申請的分案申請。

交叉引用

本申請要求2014年9月24日提交的序列號為62/054,886的美國臨時申請和2015年4月20日提交的第14/691,457號美國專利申請的優先權，其通過引用而整體并入本文。

背景技術

盡管近年來核酸測序的成本已經降低，但樣品制備仍然費用高昂。只有幾種樣品制備方法與最流行的測序平臺相兼容。這些方法可能費用高昂且又耗時。特別是，文庫制備可能需要在核酸片段上生成突出的堿基。該步驟是制備測序文庫較為低效的一步步驟。提高該步驟的效率將減少制備測序文庫所需的起始核酸的量。需要用于測序的樣品制備的新方法，特別是借此提高生成具有突出堿基的核酸片段的效率的方法。

發明內容

本文提供了用于生成核酸片段的銜接子連接的文庫的方法。特別地，公開了用于制備部分互補的雙鏈核酸片段的方法，使得一條鏈延伸超出另一條以產生突出端。這樣的突出端可以提高酶促反應和生化反應的效率。例如，這樣的突出端可與其互補序列退火，以允許核酸片段的靶向配對。在另一實例中，具有互補突出端的核酸片段的連接比平端核酸片段的連接更有效率。

在一方面，本公開內容提供了用于生成雙鏈核酸分子的銜接子連接的文庫的方法，其包括：在單一反應容器或反應混合物中，使多個單鏈多核苷酸與第一組隨機引物相接觸，每個隨機引物包含可切割5’端；延伸該第一組隨機引物以生成與該單鏈多核苷酸雜交的第一延伸產物，從而形成第一雙鏈雙鏈體；使該第一雙鏈雙鏈體變性為單鏈；使該第一多核苷酸延伸產物與第二組隨機引物雜交(該第一組引物和該第二組引物可以相同或不同)；延伸該第二組隨機引物以生成與該第一延伸產物雜交的第二延伸產物，從而形成第二雙鏈雙鏈體；切割該第一延伸產物和/或該第二延伸產物的可切割5’端，從而形成具有一個或多個突出端的第二雙鏈雙鏈體；以及使包含3’突出端的一個或多個雙鏈銜接物與先前步驟的第二雙鏈雙鏈體連接，從而形成該銜接子連接的文庫。該雙鏈銜接物在一些實例中可以包含核酸條碼，諸如樣品條碼、分子條碼或隨機化條碼。隨機引物可以是完全簡并或部分簡并的。可采用單個清理步驟來執行整個文庫制備。可采用不超過兩個清理步驟來執行整個文庫制備。可采用僅三個清理步驟來執行整個文庫制備。