[發(fā)明專利]一種檢測(cè)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH的近紅外熒光探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110250268.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112961177B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田蔣為;閆瑾;劉浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07F5/02
• 分類號(hào): C07F5/02;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 競(jìng)存;徐冬濤

1.一種實(shí)時(shí)檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針，其特征在于，該探針的結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針，其特征在于：所述近紅外熒光探針以硼二吡咯甲烷為熒光母體，喹啉鎓作為NADH的還原位點(diǎn)。

3.一種制備權(quán)利要求1所述檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

a：取式(Ⅱ)所示化合物1和3-喹啉甲醛置于裝有迪安-斯達(dá)克分水器的圓底燒瓶中，并用乙腈和哌啶的混合溶液溶解，在對(duì)甲基苯磺酸的催化下，80℃回流30分鐘，得到固體產(chǎn)物；

所述化合物1與3-喹啉甲醛物質(zhì)的量的比為1:2；所述混合溶液中，乙腈和哌啶的體積比為50:1，所述化合物1在混合溶液中的濃度為5～6mg/mL；

將所得固體產(chǎn)物溶解在二氯甲烷中，用水洗滌；將洗滌所得有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸發(fā)溶劑，所得殘?jiān)?jīng)硅膠柱層析純化，再由二元溶劑重結(jié)晶得到式(Ⅲ)所示化合物2，所述二元溶劑為二氯甲烷/正己烷；所述化合物1和化合物2結(jié)構(gòu)式如下：

b：將化合物2和碘甲烷加入到三氯甲烷中，得到混合物，所述化合物2在三氯甲烷中的濃度為20mg/mL，所述碘甲烷與三氯甲烷體積比為1:100；

室溫下，將混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌24小時(shí)，減壓蒸發(fā)溶劑，所得殘?jiān)尤攵燃淄榈玫叫碌某恋?，即為?Ⅰ)所示檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：a中所述洗滌次數(shù)為3次。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：a所二元溶劑二氯甲烷與正己烷的體積比為1：8。

6.權(quán)利要求1所述的近紅外熒光探針在檢測(cè)NADH中的應(yīng)用，其特征在于：所述近紅外熒光探針與NADH反應(yīng)之前，在652nm處有熒光發(fā)射；在與NADH反應(yīng)之后，會(huì)在700～760nm處產(chǎn)生新的熒光，為OFF-ON型熒光反應(yīng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述近紅外熒光探針與NADH反應(yīng)之前，熒光光譜儀檢測(cè)中，所述熒光探針的激發(fā)波長(zhǎng)為595nm，發(fā)射波長(zhǎng)為652nm；與NADH反應(yīng)之后，產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)為715nm，發(fā)射波長(zhǎng)為760nm。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述熒光探針的線性范圍為0.1μM～15μM的NADH，檢測(cè)限為0.20μM的NADH。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用包括以下步驟：

S1、取所述近紅外熒光探針，溶于乙腈，充分混勻，使其完全溶解，配制探針儲(chǔ)備液，放于4℃冰箱備用；

S2、制備待測(cè)樣品；所述待測(cè)樣品為NADH溶液；

待測(cè)樣品制備方法為：取NADH，溶于PBS緩沖液，配制NADH溶液；

S3、將S1得到的探針儲(chǔ)備液和S2得到的待測(cè)樣品，以及吐溫溶液混合，再用PBS緩沖液定容，所述PBS緩沖液pH＝5～8，使得探針濃度為10μM，NADH濃度為100μM，吐溫溶液的體積比為0.05％，進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為60～90分鐘；

S4、采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光測(cè)試，當(dāng)反應(yīng)體系在激發(fā)波長(zhǎng)為715nm，發(fā)射波長(zhǎng)為760nm，表示待測(cè)樣品中包含NADH。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：S1所述探針儲(chǔ)備液中，近紅外熒光探針的濃度為2×10^-3M。

11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)NADH的近紅外熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：S3所述反應(yīng)PBS緩沖液pH＝7.4，反應(yīng)時(shí)間為60分鐘。