[發(fā)明專利]一種檢測還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH的近紅外熒光探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110250268.0
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN112961177B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田蔣為;閆瑾;劉浩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: C07F5/02
• 分類號: C07F5/02;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

本發(fā)明公開了一種檢測NADH的近紅外熒光探針及其應(yīng)用，所述熒光探針以BODIPY為熒光母體，喹啉鎓作為NADH的還原位點(diǎn)，探針與NADH反應(yīng)之后，由于存在較強(qiáng)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，最大吸收波長紅移至725nm，在760nm處發(fā)射較強(qiáng)的熒光信號，不易受到生物基質(zhì)和雜質(zhì)的干擾。本發(fā)明提供的熒光探針具有較高的檢測靈敏度，且BODIPY母核具有較低的細(xì)胞毒性和較好的生物相容性，可廣泛的用于細(xì)胞和生物組織中NADH的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及近紅外熒光探針及制備方法和應(yīng)用，特別涉及具備檢測NADH的近紅外熒光探針的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在許多生物催化過程中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其磷酸酯(NADPH)分別作為還原型輔酶Ⅰ和還原型輔酶Ⅱ有著廣泛的應(yīng)用。受糖酵解、三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸的影響，NAD(P)H在能量代謝中起著至關(guān)重要的作用，是線粒體中能量產(chǎn)生鏈中的控制標(biāo)志物。監(jiān)視NAD(P)H的氧化還原狀態(tài)是表征活體內(nèi)線粒體功能的最佳參數(shù)。

NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態(tài)，還原型輔酶Ⅰ。N指煙酰胺，A指腺嘌呤，D是二核苷酸。NADH在維持細(xì)胞生長、分化和能量代謝以及細(xì)胞保護(hù)方面起著重要作用。NADH產(chǎn)生于糖酵解和細(xì)胞呼吸作用中的檸檬酸循環(huán)，并作為生物氫的載體和電子供體，在線粒體內(nèi)膜上通過氧化磷酸化過程，轉(zhuǎn)移能量供給ATP合成，所以NADH又被稱為線粒體素。NADH分子是線粒體中能量產(chǎn)生鏈中的控制標(biāo)志物。

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，病因迄今未明。有研究表明AD患者神經(jīng)元細(xì)胞線粒體內(nèi)NADH含量明顯低于非AD患者。因此，檢測NADH的近紅外熒光探針用來進(jìn)一步研究AD的發(fā)病進(jìn)程具有廣闊的應(yīng)用前景。

近紅外熒光探針作為NADH檢測的主要手段之一，在細(xì)胞及活體內(nèi)NADH檢測中發(fā)揮著重要作用。常見的傳統(tǒng)檢測NADH方法有紫外分光光度法、電化學(xué)分析法、毛細(xì)管電泳法、色譜法、酶循環(huán)法等。與這些傳統(tǒng)NADH檢測方法(只能體外檢測、信號弱、背景高等)相比，近紅外熒光探針檢測方法的靈敏度高，對活細(xì)胞無毒性，穩(wěn)定性好，反應(yīng)快，使用方便，更具有優(yōu)勢。因而構(gòu)建、研發(fā)可識別檢測NADH的近紅外熒光探針是目前NADH檢測的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

為克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，本發(fā)明目的是提供一種具備檢測NADH的近紅外熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種實(shí)時(shí)檢測NADH的近紅外熒光探針，該探針的結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

進(jìn)一步的，式(Ⅰ)所示近紅外熒光探針以硼二吡咯甲烷(BODIPY，CAS:947328-71-4)為熒光母體，喹啉鎓作為NADH的還原位點(diǎn)。

探針與NADH反應(yīng)之后，由于存在較強(qiáng)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，最大吸收波長移至715nm，并在760nm處發(fā)射較強(qiáng)的熒光信號。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下反應(yīng)步驟：

本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備前述檢測NADH的近紅外熒光探針的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

a：取式(Ⅱ)所示化合物1和3-喹啉甲醛置于裝有迪安-斯達(dá)克分水器的圓底燒瓶中，并用乙腈和哌啶的混合溶液溶解，在對甲基苯磺酸(p-TsOH)的催化下，80℃回流30分鐘，得到固體產(chǎn)物；

所述化合物1與3-喹啉甲醛物質(zhì)的量的比為1:2；所述混合溶液中，乙腈和哌啶的體積比為50:1，所述化合物1在混合溶液中的濃度為5～6mg/mL。