[發明專利]一種DNA納米結構標記細胞目的蛋白的熒光染色方法

有效

• 申請號: 202110249529.7
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN113514429B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發明（設計）人: 馬炯;姚龍芳;糜嵐;張麗;陳麗雯;王保舉
• 申請（專利權）人: 復旦大學;珠海復旦創新研究院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 王潔平

本發明屬于超分辨顯微成像技術領域，具體為一種DNA納米結構標記細胞目的蛋白的熒光染色方法。其用鏈霉親和素作中間物，將DNA納米結構和修飾有生物素的目的蛋白的抗體連接在一起，從而標記目的蛋白；其中：所述DNA納米結構上同時修飾有生物素、錨定在水凝膠上的基團和兩個以上熒光染料分子。本發明的DNA納米結構除修飾同一種染料時，其亮度非常高，得到的顯微圖片質量會大幅提高。當修飾STED超分辨顯微技術優勢染料時，則膨脹顯微技術能夠與STED超分辨技術很好地結合。當修飾熒光共振能量轉移的染料對時，能使DNA納米結構有閃爍的性質，使膨脹顯微技術更加方便地與STORM和SOFI超分辨技術結合。

技術領域

本發明屬于光學顯微技術領域，具體涉及一種DNA納米結構標記細胞目的蛋白的熒光染色方法。

背景技術

膨脹顯微成像技術是通過熒光特異性標記目標物，如蛋白、DNA、RNA等，將熒光基團錨定在水凝膠上，當水凝膠在水里膨脹的時候，本來在光學衍射極限內靠在一起無法區分開的熒光分子隨著膠一起膨脹，它們彼此之間的距離增大，這樣就能夠用普通的顯微成像設備獲取分辨率更高的圖像。因為膨脹顯微成像技術的操作簡單，原材料易得，所以它在單細胞動物、細胞系、組織甚至動物體重都有著廣泛的應用。

樣品各向同性地均勻地膨脹，是保證樣品結構不會畸變的重要條件。要保證均勻膨脹，蛋白酶要盡可能將樣品中維持生物體結構的蛋白消化完全，以減少結構之間的拉扯力。但是，如果消化過頭，熒光蛋白的熒光基團會被蛋白酶打斷，連接在抗體上的染料也會脫落，在膨脹過程中，沒有錨定在水凝膠上的熒光分子會被洗掉，而且在凝膠形成過程中產生的自由基也會破壞熒光基團。以上這些原因導致熒光信號的大量損失，樣品的有效標記密度低會嚴重影響成像質量。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種DNA納米結構標記細胞目的蛋白的熒光染色方法。該方法以鏈霉親和素和生物素為媒介，利用DNA納米結構具有多端點（游離基）可以修飾多個熒光染料的優勢以及將不被蛋白酶消化的特性對目的蛋白進行標記，不僅能夠克服現有膨脹顯微技術中樣品被蛋白酶消化導致的樣品熒光信號大量損失的缺點，而且能夠大大提高熒光標記的亮度，使顯微圖片信噪比更高，圖片質量更好。如果修飾同一種染料，該DNA納米結構的亮度將非常高，得到的顯微圖片質量會大大提高。如果修飾的染料分子是STED超分辨顯微技術優勢染料，則膨脹顯微技術能夠與STED超分辨技術很好地結合。如果修飾熒光共振能量轉移的染料對，還能使DNA納米結構有閃爍的性質，使膨脹顯微技術更加方便地與STORM和SOFI超分辨技術結合。

為達到上述目的，本發明采取下述技術方案。

一種DNA納米結構標記細胞目的蛋白的熒光染色方法，其用鏈霉親和素作中間物，將DNA納米結構和修飾有生物素的目的蛋白的抗體連接在一起，從而標記目的蛋白；其中：所述DNA納米結構上同時修飾有生物素、錨定在水凝膠上的基團和兩個以上熒光染料分子。

本發明中，DNA納米結構為DNA雙鏈結構、DNA四面體結構或其他更復雜的空間結構。

本發明中，熒光染料分子為同一種或不同種。相較于其他用于膨脹的DNA分子，本發明的DNA納米結構有多頂點優勢，除了生物素和丙烯酰胺基占據了兩個頂點，其余的頂點都可以修飾熒光染料。如果修飾同一種染料，該DNA納米結構的亮度將非常高，得到的顯微圖片質量會大大提高。如果修飾的染料分子是STED超分辨顯微技術優勢染料，則膨脹顯微技術能夠與STED超分辨技術很好地結合。如果修飾熒光共振能量轉移的染料對，還能使DNA納米結構有閃爍的性質，使膨脹顯微技術更加方便地與STORM和SOFI超分辨技術結合。

本發明中，DNA納米結構中錨定在水凝膠上的基團有且不限于丙烯酰胺基團等。

本發明中，涉及到免疫熒光過程，但是所用的抗體帶的不是熒光基團，而是生物素，所要標記的目的蛋白的一抗上連有生物素，或者是二抗上連有生物素。

本發明中，DNA納米結構標記細胞目的蛋白的熒光染色方法的具體步驟如下：