[發明專利]一種誘導型堿基編輯系統及其應用

有效

• 申請號: 202110249394.4
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN112877314B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 姚少華;龍潔
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N9/22;C12N15/113
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 代維凡

本發明公開了一種誘導型堿基編輯系統及其應用。該堿基編輯系統包括可誘導的人來源胞嘧啶脫氨酶(A3A)與單切口活性的SpCas9組成；脫氨酶能基于潛在的氨基酸位點進行拆分；雷帕霉素通過FRB/FKBP與氨基酸拆分位點的N端和C端相互作用而重組裝分裂的脫氨酶，并誘導完成堿基編輯。本申請通過構建誘導型堿基編輯系統來控制其堿基編輯活性，從而減少脫靶編輯；同時，本申請中的拆分設計不會減少目標編輯，因此，可以作為蛋白質突變的補償策略，并且可以與這些突變的脫氨酶結合使用，以進一步減少脫靶編輯。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種誘導型堿基編輯系統及其應用。

背景技術

堿基編輯是一種基因組編輯策略，可直接在基因組DNA中轉換特定的單個核苷酸(Rees?and?Liu?2018)。目前，堿基編輯器有兩種類型，胞嘧啶堿基編輯器(CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(ABE)，兩者都由脫氨酶與催化缺陷的Cas9蛋白組成，該酶可催化胞嘧啶或腺嘌呤的脫氨反應。在sgRNA的指導下，堿基編輯器可以在靶點內特定窗口的幾個堿基對中將C-G堿基對轉換為T-A堿基對，或將A-T堿基對轉換為G-C堿基對。因為它高效且精確，并且不會產生由DNA雙鏈斷裂(DSB)引入的插入或缺失等副產物，所以該技術很快被廣泛用于各種模式生物中，例如小鼠，斑馬魚，擬南芥和釀酒酵母。

盡管堿基編輯技術在廣泛的基礎研究中取得了許多令人振奮的成果，但是堿基編輯在臨床應用中仍然存在一個主要阻礙，即在DNA或RNA水平上的脫靶效應。當前的CBE和ABE通常會引起RNA中全轉錄組范圍內的脫靶，引起了對安全性問題的關注。更嚴重的是，由于CBE還會造成DNA水平的脫靶，可能進一步導致包括癌癥在內的病理狀況。實際上，早在三十多年前，研究人員發現過表達APOBEC1(CBE中使用的最流行的胞嘧啶脫氨酶之一)可導致轉基因小鼠患上肝癌。隨后，AID也被發現在小鼠中過表達會誘導腫瘤的發生。基于這些發現，越來越多的研究證實了胞嘧啶脫氨酶與多種組織中的腫瘤發生之間的聯系。已發現的胞嘧啶脫氨酶的成員中，如APOBEC3B，在多種實體瘤。

已發現胞嘧啶脫氨酶的過表達能夠誘導基因組DNA中的堿基替換，從而損害基因組穩定性。更重要的是，已發現許多腫瘤細胞帶有以胞嘧啶標記為特征的SNV。因此，不受控制的堿基編輯器(尤其是CBE)可能會產生腫瘤。考慮到AAV是目前最有效的體內傳遞載體之一，AAV注射后會使轉基因在體內長期表達，使用這種載體傳遞堿基編輯器無疑會放大脫靶后果。因此，我們迫切需要探索活性可控的新型堿基編輯工具。

發明內容

針對現有技術中的上述不足，本發明提供一種誘導型堿基編輯系統及其應用，通過構建拆分式堿基編輯系統，并能通過雷帕霉素的誘導來控制其堿基編輯活性，通過該方案能夠有望縮短編輯時間。同時，本申請中的拆分設計不會減少目標編輯，因此，可以作為蛋白質突變的補償策略，并且可以與這些突變的脫氨酶結合使用，以進一步減少脫靶編輯。

近年來，許多研究表明堿基編輯器存在的DNA和RNA的脫靶效應。本發明通過控制脫氨酶活性進而控制堿基編輯器的編輯編輯活動，從而降低脫靶效應。本發明的堿基編輯系統包括可誘導的人源胞嘧啶脫氨酶(A3A)與單切口活性的SpCas9。具體方案為：將A3A分裂為失活的N端和C端后，分別與FRB和FKBP蛋白融合，FRB和FKBP在雷帕霉素誘導下形成穩定的三元復合物，從而使脫氨酶重新組裝成有功能性的A3A。由于脫氨酶的活性可受誘導劑調控，進而該堿基編輯器的活性是可控的。

為實現上述目的，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種誘導型堿基編輯系統，堿基編輯系統包括堿基編輯器，以及與其結合的雷帕霉素；堿基編輯器包括脫氨酶；

脫氨酶能基于任一氨基酸位點進行拆分；雷帕霉素通過拆分后的氨基酸位點與脫氨酶結合，并誘導完成堿基編輯。

進一步地，堿基編輯器為由脫氨酶和BE3/SpCas9組成的堿基編輯器。