[發明專利]一種測定配方乳粉中酪蛋白含量的雙曲線法

在審

• 申請號: 202110248240.3
• 申請日: 2021-03-07
• 公開（公告）號: CN112858561A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 周紅;張麗宏;張秋梅;盧雁;唐曉娜;于力濤;楊金寶;鄂來明
• 申請（專利權）人: 黑龍江省綠色食品科學研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 哈爾濱東方專利事務所 23118
• 代理人: 陳曉光

1.一種測定配方乳粉中酪蛋白含量的雙曲線法，其特征是：該方法包括如下步驟：首先是將被測樣品經6mol/L鹽酸于110℃水解22小時，水解溶液定容50mL后過濾，樣品濾液和標準品溶液同時用衍生劑衍生，衍生物經高效液相色譜儀或超高效液相色譜儀分離、紫外檢測器檢測，測定出纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，樣品中酪蛋白含量與其所含的兩種氨基酸含量比值存在二次函數的曲線關系，用不同含量的酪蛋白值與其所含的纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸中兩種氨基酸比值制作兩個定量曲線方程，將被測樣品中測得的相應氨基酸比值分別帶入相應的曲線方程，計算出兩個酪蛋白含量值，取平均值為測定結果；

（1）試樣的制備

A、氨基酸試樣制備：稱取適量樣品，其中蛋白質含量為10.0～30.0mg，置于帶密封墊螺紋蓋水解管中，向水解管內加45℃～50℃的溫水6mL，輕輕震蕩溶解樣品，再加入濃鹽酸6mL，輕震混勻，充入氮氣1min后，擰緊螺絲蓋，將水解管放在110℃±1℃的恒溫干燥箱內水解22 h后取出冷卻至室溫；

將水解液用超純水轉移并定容至50 mL容量瓶中，殘液洗三次，洗液合并后定容，混勻，濾紙過濾，吸取濾液1 mL放入指型瓶中，在60 ℃±2 ℃氮吹儀上濃縮至干或在低于50 ℃下減壓蒸餾至干，殘留物用1 mL超純水溶解，即為試樣溶液；

B、游離氨基酸試樣制備：準確稱取混合均勻的樣品約2.5 g，精確至0.0001 g放入100mL錐形瓶中，加入約25 mL45 ℃～50 ℃溫水溶解，降至室溫后用鹽酸溶液調節樣品溶液的pH值至1.7±0.1，放置約1 min，再用氫氧化鈉溶液調節樣品溶液的pH值至4.5±0.1，超聲振蕩約10 min，用水轉移并定容至50 mL容量瓶中混勻，濾紙過濾后經0.22 μm濾膜過濾，濾液即為試樣溶液；

（2）曲線的制作

A、氨基酸標準曲線制作：將標準工作液衍生液注入到超高效液相色譜儀或高校液相色譜儀中，得到氨基酸標準工作液的峰面積，以標準工作液的峰面積為縱坐標，以標準工作液濃度μmol/mL為橫坐標繪制標準曲線，該曲線用于計算各氨基酸濃度和含量，其中含量以每100克蛋白質中氨基酸所含克數表示；

B、樣品定量計算的雙曲線制作：以配制的不同酪蛋白含量為縱坐標，以上機測定后得到的纈氨酸/丙氨酸、纈氨酸/脯氨酸或其比值的倒數為橫坐標，分別制定兩個定量計算曲線，即雙曲線，得到兩個曲線方程，要求相關系數平方值≥0.9980；

（3）樣品溶液的測定

將樣品待測液注入到超高效液相色譜儀或高效液相色譜儀中得到峰面積，根據氨基酸標準曲線得到樣品待測液中所需氨基酸的濃度μmol/mL，并可計算其含量及所需氨基酸比值；

（4）總蛋白的測定

樣品中總蛋白的測定，在催化加熱條件下使蛋白質分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，堿化蒸餾時氨游離被硼酸吸收，用硫酸或鹽酸滴定，根據酸的消耗體積乘以換算系數計算，即為蛋白質含量；

（5）氨基酸的計算

樣品中各氨基酸占乳蛋白的含量按下列公式計算：

其中：

X——樣品中氨基酸的含量，單位為克每百克蛋白質；

X1——樣品中總氨基酸的含量，單位為克每百克蛋白質；

X2——樣品中游離氨基酸的含量，單位為克每百克蛋白質；

C1——從標準曲線中獲得試樣總氨基酸測定液的濃度,單位為微摩每毫升μmol/mL；

C2——從標準曲線中獲得游離氨基酸測定液的濃度，單位為微摩每毫升μmol/mL；

m1——稱取的測定水解氨基酸樣品的質量，單位為克；

m2——稱取的測定游離氨基酸的樣品的質量，單位為克；

MAA——各氨基酸的摩爾質量，單位為克每摩爾g/mol；

V1——測定水解氨基酸樣品的體積，單位為毫升；

V2——測定游離氨基酸樣品的體積，單位為毫升；

n1——測定水解氨基酸樣品的稀釋倍數；

n2——測定游離氨基酸樣品的稀釋倍數；

P——乳清蛋白含量，單位為克每百克；

Pz——總蛋白含量，單位為克每百克；

PF——乳酪蛋白含量，單位為克每百克；

（6）酪蛋白含量計算

由實驗得到被測樣品相應的氨基酸含量比值分別代入各自雙曲線方程，得到兩個酪蛋白含量，取平均值為測定結果，保留至小數點后一位，如需要計算乳清蛋白，則用100減去酪蛋白含量即得到乳清蛋白含量；

（7）精密度

雙曲線測得的兩個酪蛋白含量的絕對差值不得超過其算術平均值的5%。