[發明專利]GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備及鑒定方法

在審

• 申請號: 202110244770.0
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN113061181A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 戴迎春;侯玉珍;王璐;張緒富
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K1/22;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

本發明提供的一種GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備及鑒定方法，包括：S1：利用GII.17NoV目標對象恢復期外周血和合成人抗體基因的引物制備得到scFv基因，構建重組質粒pCANTAB?5E?scFv電轉化后培養獲得初級全人源噬菌體單鏈抗體庫。S2：采用甘氨酸?鹽酸洗脫法富集淘篩并以GII.17NoV P顆粒為固相抗原，制備得特異性GII.17NoV噬菌體單鏈抗體庫，離心制備噬菌體上清，Phage?ELISA鑒定噬菌體上清的特異性。S3：設計原核表達引物，以步驟S2的陽性噬菌體上清的菌液為模板，擴增scFv片段，構建pGEX?scFv重組質粒，利用大腸桿菌表達系統表達pGEX?scFv重組質粒，再用GST?resin親和層析柱純化，加入凝血酶去除融合標簽蛋白GST?tag后獲得scFv純蛋白。該方法制備出的GII.17NoV全人源單鏈抗體有效庫容大，且重組率和多樣性好。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，特別是涉及一種GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備及鑒定方法。

背景技術

諾如病毒(norovirus，NoV)是引起全球各年齡段人群急性胃腸炎(acutegastroenteritis，AGE)暴發流行及散發的主要病原體，由NoV引起的AGE占全球AGE發病總數的近五分之一。由于NoV的低感染劑量及傳播途徑的多樣化，導致NoV能夠在醫院、學校、餐廳等半封閉的環境中迅速傳播。在全球范圍內，NoV感染每年可致約6.99億AGE病例和22萬人死亡。在中國，NoV一年可引起80萬人感染AGE，年均發病率為6.0/100人年，特別是小于5歲的兒童，年均發病率約為15.6/100人年。由此可見，NoV的暴發流行及散發是我國及世界范圍內的一個重要公共衛生問題。

NoV屬杯狀病毒科，是單股正鏈小RNA病毒，直徑為27～38nm，基因組全長為7.4～7.7kb。基于VP1氨基酸序列的多樣性，可將NoV分為GI～GX共10個基因組，49個基因型。10個基因組中GI、GII和GIV基因組可感染人類。GII.4NoV是自1996年以來暴發流行及散發最主要的基因型，占所有NoV相關胃腸炎暴發的70％-80％。然而2014年以來，中國、日本等亞洲國家均報道了由GII.P7-GII.17新變異株引起的NoV相關胃腸炎暴發。在2014-2015年間，這一變異株在NoV暴發中占76.9％，并取代GII.4/2012Sydney株，成為我國2014～2015和2015～2016NoV流行季的主要流行株。

病毒受體是公認的引發病毒感染宿主細胞的起始步驟和關鍵因素之一，病原體往往為了適應不同的受體表型選擇性進化。研究發現，人類組織血型抗原(Histo-bloodinggroup antigen，HBGA)是NoV的病毒受體或病毒附著因子，是研究NoV易感性和致病性的重要因素。

目前，NoV缺乏成熟的細胞培養系統及小動物感染模型，其疫苗和特異性抗病毒藥物研究進展仍較緩慢。在過去30年中GII.4NoV一直是全球范圍內的優勢流行株，因此，現階段NoV疫苗和特異性抗體藥物的開發及研制主要集中在GII.4，然而GII.4抗體免疫對與GII.17感染不存在交叉保護作用。GII.17感染造成急性胃腸炎的問題仍然沒有被解決，繼續危害人類健康。

因此，針對現有技術不足，提供一種GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體制備及鑒定方法料以克服現有技術不足甚為必要。

發明內容

本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備方法，制備的GII.17 NoV全人源單鏈抗體的有效庫容大，且重組率和多樣性好，為NoV的臨床防治及相關疫苗的研制奠定了基礎。

本發明的目的通過以下技術措施實現：

提供一種GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備方法，包括下列步驟：

S1：構建初級全人源噬菌體單鏈抗體庫。