[發(fā)明專利]GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備及鑒定方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110244770.0
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN113061181A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴迎春;侯玉珍;王璐;張緒富
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K1/22;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

1.一種GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備方法，其特征在于，包括下列步驟：

S1：構(gòu)建全人源噬菌體單鏈抗體庫；

具體是，采集GII.17NoV目標(biāo)對象恢復(fù)期外周血，利用密度梯度離心法分離出PBMC，利用Trozil法提取PBMC的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

設(shè)計合成人抗體基因的引物，并以cDNA為模板，擴增抗體重鏈可變區(qū)基因V_H和輕鏈可變區(qū)基因V_L，重疊延伸PCR拼接V_H和V_L形成scFv基因；

線性化噬菌粒載體pCANTAB-5E，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv，將重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv電轉(zhuǎn)化至E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞后加入輔助噬菌體M13K07培養(yǎng)，得到全人源噬菌體單鏈抗體庫，并挑取抗體庫中單克隆做菌液PCR且對陽性克隆進(jìn)行測序分析；

S2：對全人源噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行淘篩及特異性鑒定；

具體是，以GII.17NoV P顆粒為固相抗原，對全人源噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行富集性篩選獲得與GII.17NoV結(jié)合的噬菌體并擴增，得到特異性GII.17NoV噬菌體單鏈抗體庫；

將特異性GII.17NoV噬菌體單鏈抗體庫鋪到氨芐抗性瓊脂板上挑取單克隆，補加輔助噬菌體M13K07拯救，離心制備噬菌體上清，用Phage-ELISA鑒定噬菌體上清的特異性，并選取陽性克隆進(jìn)行測序分析；

S3：制備GII.17NoV全人源單鏈抗體；

具體是，設(shè)計原核表達(dá)引物，以步驟S2所得陽性噬菌體上清的菌液為模板，擴增scFv片段，使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I雙酶切載體pGEX-4T-1，并將scFv片段重組克隆至載體pGEX-4T-1上，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli T0P10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆做菌液PCR，鑒定重組質(zhì)粒是否插入目的片段，并對陽性克隆進(jìn)行測序分析后提取獲得pGEX-scFv重組質(zhì)粒；

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)pGEX-scFv重組質(zhì)粒，然后用GST-resin親和層析柱純化，加入凝血酶去除融合蛋白GST-scFv的蛋白標(biāo)簽GST后獲得scFv，即GII.17NoV全人源中和性單鏈抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備方法，其特征在于，步驟S1中GII.17型NoV目標(biāo)對象恢復(fù)期外周血來自由GII.17NoV引起的急性胃腸炎暴發(fā)目標(biāo)對象。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備方法，其特征在于，步驟S1中人抗體基因的引物包括6對VH家族基因、用于連接抗體重輕鏈的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS的兩條互補連接肽、12對VL家族基因以及Sfi I和Not I酶切位點的scFv上下游引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備方法，其特征在于，步驟S1中構(gòu)建重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv的具體過程為，分別使用限制性內(nèi)切酶Sfi I和Not I對scFv基因和噬菌粒載體pCANTAB-5E雙酶切，然后用T4連接酶連接構(gòu)建形成重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv；

輔助噬菌體M13K07與E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞的MOI＝100：1，輔助噬菌體M13K07的滴度為10～12pfu/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的GII.17型諾如病毒全人源中和性單鏈抗體的制備方法，其特征在于，步驟S2中富集性篩選具體為將GII.17NoV P顆粒包被免疫管，吸附噬菌體單鏈抗體庫，然后采用甘氨酸-鹽酸洗脫法進(jìn)行富集性淘選，重復(fù)進(jìn)行4輪吸附-洗滌-洗脫-感染-拯救的過程，獲得與GII.17NoV P顆粒結(jié)合的噬菌體，然后將與GII.17NoV P顆粒結(jié)合的噬菌體洗脫下來用于擴增。