[發明專利]一種生物法生產四氫嘧啶的工程菌株的構建方法

有效

• 申請號: 202110243895.1
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN112961875B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 林凌;孟銳;蘇月;朱國萍
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/54;C12N15/60;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 吳頻梅

本發明公開了一種生物法生產四氫嘧啶工程菌株的構建方法及其在四氫嘧啶生產中的應用。本發明提供的工程菌株利用海洋微生物鹽棲鹽田菌Salinicola salaria的四氫嘧啶合成基因簇的異源表達，使氨基丁酸乙酰基轉移酶、二氨基丁酸氨基轉移酶和四氫嘧啶合成酶在大腸桿菌中串聯高表達，再經過酶促反應催化天冬氨酸鈉生成四氫嘧啶。該四氫嘧啶的生物轉化方法具有反應溫度溫和、工藝簡單、轉化率高的特點。

技術領域

本發明屬于醫藥原料生產技術領域，具體涉及一種生產四氫嘧啶的工程菌株構建方法，以及該菌株生產應用。

背景技術

四氫嘧啶(Ectoine)的化學名稱為1，4，5，6-四氫-2-甲基4-嘧啶羧酸、依克多因，是一種雜環氨基酸衍生物。它化學性質穩定，為白色結晶或結晶性粉末，熔點280℃，具極性、易溶于水，溶于甲醇，在生理酸堿度范圍內不帶電荷。

1985年科學家Galinski等人在研究生存于海洋中高pH值、極端鹽環境里的光合細菌時，首次發現嗜鹽綠外硫紅螺菌Ectothiorhodospira halochloris體內中存在一種相容性溶質——四氫嘧啶。作為一種重要的滲透壓補償性、相容性溶質，四氫嘧啶能夠維持內的滲透壓平衡，幫助嗜鹽微生物在高鹽、高滲環境下生存；同時其獨特分子結構具有很強的水分子絡合能力，能使細胞內的游離水結構化，是非常優秀的天然保濕劑；近年來發現，四氫嘧啶還可以對處于高溫、冷凍、射線等極端環境中細菌細胞的蛋白質、酶、核酸等起到保護作用，對抗紫外線對皮膚的傷害，修復紫外線導致的細胞DNA損傷。因此，目前四氫嘧啶主要應用于生物制劑、酶制劑等工業領域，以及具有保濕修復功能的護膚品和化妝品行業，這對人類的生產生活有著極其重要的意義。

由于四氫嘧啶的化學生產工藝復雜，且容易出現結構相似的副產物，導致后續分離成本過高，因此目前四氫嘧啶多通過生物發酵轉化法進行生產。德國默克公司利用延長鹽單胞菌Halomonas elongate發酵合成目的產物，再通過“細菌擠奶”的滲透壓法提取純化獲得四氫嘧啶；近年來，國內外學者通過代謝工程手段，構建了一系列的大腸桿菌工程菌株進行全細胞催化合成生產，具有一定的市場優勢。

文獻He et al.Microbial Cell Factories(2015)14:55DOI 10.1186/s12934-015-0238-0描述了一種異源生物合成四氫嘧啶的方法，將來源于延長鹽單胞菌Halomonaselongata的四氫嘧啶合成基因簇插入pBAD載體，在大腸桿菌中表達出氨基丁酸乙酰基轉移酶、二氨基丁酸氨基轉移酶和四氫嘧啶合成酶；搖瓶反應體系中添加OD₆₀₀＝5的發酵菌體、100mM天冬氨酸鈉、100mM甘油、100mM氯化鉀以及100mM pH 7.0磷酸緩沖溶液，轉化條件為30℃反應，搖床轉數為200rpm，反應24小后，獲得四氫嘧啶的產量為2.67g/L。通過發酵罐進行高密度菌體生產轉化，30℃反應24小時后，獲得的四氫嘧啶的產量為25.1g/L。

文獻Y.Ning et al.Metabolic Engineering 36(2016)10-18DOI 10.1016/j.ymben.2016.02.013報道了多株合成四氫嘧啶的大腸桿菌W3110工程菌株，將來源于延長鹽單胞菌Halomonas elongata的四氫嘧啶合成基因簇插入pTrc99a載體，在工程菌株中表達四氫嘧啶合成所需要的三種酶，同時對代謝通路進行了改造，提高了代謝流通路，并敲除了高絲氨酸和賴氨酸的代謝分支以積累代謝中間產物；在搖瓶反應體系中添加60％的葡萄糖，轉化條件為36℃反應，搖床轉數為200rpm，反應24小后，獲得四氫嘧啶的產量為4.88～13.6g/L。通過發酵罐進行高密度菌體生產轉化，36℃反應24小時后，獲得的四氫嘧啶的產量為25.1g/L。