[發明專利]一種生物法生產四氫嘧啶的工程菌株的構建方法

有效

• 申請號: 202110243895.1
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN112961875B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 林凌;孟銳;蘇月;朱國萍
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/54;C12N15/60;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 吳頻梅

1.一種生物法生產四氫嘧啶的工程菌株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)用EcoR I和Nde I分別雙酶切來自于鹽棲鹽田菌Salinicola salaria的四氫嘧啶合成基因簇，克隆至用EcoR I和Nde I酶切過的pET24載體上，得重組載體pET-ECT；

(2)將重組載體pET-ECT轉入大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)，得工程菌BL21-ECT；

所構建的重組菌株通過聚合酶啟動轉錄四氫嘧啶合成基因簇，串聯高表達其中的氨基丁酸乙酰基轉移酶、二氨基丁酸氨基轉移酶和四氫嘧啶合成酶；

所述的四氫嘧啶合成基因簇的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的氨基丁酸乙酰基轉移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的二氨基丁酸氨基轉移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的四氫嘧啶合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根據權利要求1所述生物法生產四氫嘧啶的工程菌株的構建方法，其特征在于，步驟(1)包括如下步驟：

用EcoR I和Nde I雙酶切合成的長度為2416bp的四氫嘧啶合成基因簇DNA片段；用EcoRI和Nde I雙酶切載體pET24，酶切體系：DNA 43μL，Buffer R 5μL，Nde I 1μL，EcoR I 1μL，37℃保溫3小時；酶切的DNA片段膠回收，用T4連接酶連接四氫嘧啶合成基因簇DNA和載體片段，連接體系如下：DNA 7.5μL，pET24載體1.5μL，Buffer 1μL，T4連接酶1μL，保溫16℃過夜，連接產物采用熱激法轉化至大腸桿菌宿主菌DH5α中；涂布到含有1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化鈉及1.5％瓊脂粉的LB固體培養基上；LB平板在37℃培養至生長出轉化子，挑取單菌落，用LB液體培養基37℃培養過夜，12000rpm離心1分鐘，提取質粒，提取方法按照試劑盒說明書操作；用EcoR I和Nde I雙酶切重組載體，酶切體系：DNA 43μL，Buffer R 5μL，Nde I1μL，EcoR I 1μL，37℃保溫3小時；

電泳確定含有四氫嘧啶合成基因簇的DNA片段。

3.根據權利要求1或2所述的生物法生產四氫嘧啶的工程菌株的構建方法，其特征在于，步驟(2)包括如下步驟：采用熱激法將重組載體轉化至大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)中；涂布到含有1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化鈉及1.5％瓊脂粉的LB固體培養基上；LB平板在37℃培養至生長出轉化子，挑取單菌落，獲得工程菌BL21-ECT。

4.一種權利要求1所述構建方法所構建的四氫嘧啶工程菌株的生物法轉化方法，其特征在于，包括如下步驟：

a.誘導發酵獲得大量表達的氨基丁酸乙酰基轉移酶、二氨基丁酸氨基轉移酶和四氫嘧啶合成酶；

b.收集菌體、重懸浮作為酶液，并添加天冬氨酸鈉底物，轉化生成產物四氫嘧啶。

5.根據權利要求4所述的生物法轉化方法，其特征在于，步驟a中包括：配種子液100mL，種子液含有蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，余量為純凈水，氨水調pH 7.0～7.2；裝在250mL三角瓶中滅菌后，接種平板培養基上的單菌落，搖床轉數為200rpm；37℃培養16小時后，接種入含有100mL發酵液的500mL三角瓶中，發酵液含有蛋白胨1.2％，酵母提取物2.4％，甘油0.4％，磷酸二氫鉀0.23％，磷酸氫二鉀1.25％，余量為純凈水；發酵培養條件：37℃培養，搖床轉數為200rpm，接種后2小時后，降溫至25～28℃，加入終濃度0.2mM IPTG，培養12小時。

6.根據權利要求4或5所述的生物法轉化方法，其特征在于，步驟b中包括：發酵培養結束后，4500rpm 4℃低溫離心收集菌體；在100mL pH 6.5的磷酸緩沖液體系中，分別加入OD₆₀₀＝5-20菌體，100-300mM天冬氨酸鈉，50-150mM葡萄糖，0-200mM氯化鉀，轉化條件：20-35℃反應，搖床轉數為180rpm；24小時后，通過高效液相色譜HPLC檢測四氫嘧啶產量。

7.根據權利要求6所述的生物法轉化方法，其特征在于，步驟b中包括：發酵培養結束后，4500rpm 4℃低溫離心收集菌體；在100mL pH 6.5的磷酸緩沖液體系中，分別加入OD₆₀₀＝10，200mM天冬氨酸鈉，100mM葡萄糖，50mM氯化鉀；轉化條件：25℃反應，搖床轉數為180rpm；24小時后，通過高效液相色譜HPLC檢測四氫嘧啶產量。