[發(fā)明專利]一種定點(diǎn)突變的水稻隱色素及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110243351.5
• 申請(qǐng)日: 2021-03-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112899244B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱國(guó)萍;劉莉;王鵬;文斌;徐蕾;胡德港;王孟黎;陳雪霏;卞命杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12N15/52;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京元本知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 范奇

本發(fā)明公開(kāi)了一種定點(diǎn)突變的水稻隱色素及其構(gòu)建方法,本發(fā)明從基因庫(kù)中獲得基因序列，進(jìn)行人工密碼子優(yōu)化并且進(jìn)行蛋白質(zhì)羧基端截短之后，獲得目的基因序列與pET22b質(zhì)粒連接，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒。截短后基因序列如SEQ ID NO:1所示。設(shè)計(jì)突變引物，利用重組質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，并將該突變重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建出用于水稻隱色素表達(dá)的基因工程菌；本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，表達(dá)的突變體酶D393N的聚合形式發(fā)生改變，具有更高的表達(dá)量，為體外研究提供了便利；其光還原產(chǎn)生的自由基更多，氧化更緩慢，因此D393N突變體酶有利于其調(diào)控水稻的開(kāi)花周期，使水稻可以趨避利害，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因、蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻隱色素基因及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

隱色素和光修復(fù)酶兩種蛋白構(gòu)成了隱色素/光修復(fù)酶蛋白家族(cryptochrome/photolyase family,CPF)，隱色素是由光修復(fù)酶進(jìn)化而來(lái)，該家族蛋白具有較高的序列同源性，且具有相似的空間結(jié)構(gòu)，但是二者功能有很大差別。早期的地球氧氣稀薄，大氣中沒(méi)有形成臭氧層，導(dǎo)致紫外線可以無(wú)阻隔的到達(dá)地球，中、短波紫外線會(huì)造成生物體的DNA損傷，對(duì)生物有很強(qiáng)的殺傷作用。光修復(fù)酶能夠修復(fù)中短波紫外線造成的DNA損傷，主要是吸收藍(lán)光和長(zhǎng)波紫外線的光能來(lái)進(jìn)行光活化。而隱色素缺乏光修復(fù)能力，是調(diào)節(jié)植物和動(dòng)物晝夜節(jié)律的光感受器，并作為受體控制植物對(duì)藍(lán)光或長(zhǎng)波紫外線光的光形態(tài)發(fā)生。

光修復(fù)酶和隱色素都借助黃素類輔酶吸收光能來(lái)發(fā)揮作用。所有的隱色素和光修復(fù)酶都能結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD)。FAD具有多種氧化還原形式，分為以下幾種：完全氧化型(oxidized,FAD_ox)，自由基型(semiquinone)和還原型(hydroquinone)。在光修復(fù)酶中FAD輔酶的活性形式為還原型，隱色素中FAD輔酶的活性形式為自由基型。

水稻做為中國(guó)主要種植品種，水稻的種植面積為3千萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量高達(dá)2億噸以上。水稻隱色素能夠藍(lán)光抑制下胚軸伸長(zhǎng)、藍(lán)光刺激子葉展開(kāi)、調(diào)控開(kāi)花時(shí)間及氣孔開(kāi)放、引導(dǎo)晝夜節(jié)律和調(diào)節(jié)基因表達(dá)，因此可以利于水稻隱色素調(diào)控開(kāi)花周期，使水稻的生長(zhǎng)趨利避害，提高水稻產(chǎn)量，這將對(duì)國(guó)內(nèi)民生產(chǎn)生重大的影響。而目前對(duì)水稻隱色素的研究較為稀缺。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所要解決的第1個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種定點(diǎn)突變的水稻隱色素基因。

本發(fā)明所要解決的第2個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供含有該基因的表達(dá)載體。

本發(fā)明所要解決的第3個(gè)技術(shù)問(wèn)題是含有該基因的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明所要解決的第4個(gè)技術(shù)問(wèn)題是所述水稻隱色素的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種定點(diǎn)突變的水稻隱色素，該隱色素所編碼的基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

一種定點(diǎn)突變的水稻隱色素基因的編碼蛋白，該編碼蛋白具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

一種載體，所述的載體為重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有所述的定點(diǎn)突變的水稻隱色素基因的重組質(zhì)粒。

一種宿主，所述的宿主為定點(diǎn)突變的水稻隱色素重組工程菌，該工程菌為大腸桿菌且含有所述的重組質(zhì)粒表達(dá)載體，以及核苷酸序列。

本發(fā)明采用定點(diǎn)突變的方法改造蛋白：通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在目的DNA片段(質(zhì)粒，基因組)中引入所需變化(包括堿基的添加，刪除，點(diǎn)突變)。