[發明專利]一種用于PCR檢測的核酸組合物的制備方法及其制備的核酸組合物和PCR檢測方法

有效

• 申請號: 202110243143.5
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN113046424B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 為朔醫學數據科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 陳秋夢

本發明公開了一種用于PCR檢測的核酸組合物的制備方法及其制備的核酸組合物和PCR檢測方法，涉及基因檢測技術領域，該制備方法包括制備引物對和發卡探針；所述引物對中上游引物的5’端具有標簽序列，所述標簽序列的堿基序列與所述發卡探針的堿基序列相同。按照該制備方法進行制備的核酸組合物可用于檢測絕大多數SNP位點，且無需針對不同的SNP位點進行特異性探針的設計，降低了SNP檢測技術開發的難度，同時也降低了SNP檢測試劑研發的成本。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，具體而言，涉及一種用于PCR檢測的核酸組合物的制備方法及其制備的核酸組合物和PCR檢測方法。

背景技術

單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，包括堿基的轉換、顛換、缺失和插入。SNP是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90％以上，據估計，人類基因組中平均每1000個核苷酸就有一個SNP，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs。SNP因其具有分布密度高、遺傳穩定性好、與疾病和表型關聯度強、易于進行高通量檢測等特點，被廣泛應用于人類的疾病篩查、疾病診斷、疾病易感性檢測以及個體化用藥指導之中。

目前，很多方法可用于人類基因組SNP檢測，例如PCR-瓊脂糖凝膠法、PCR-斑點雜交法、PCR-單堿基延伸法、Sanger測序法、實時熒光PCR法、基因芯片法、數字PCR法以及二代測序法等。雖然SNP檢測的方法較多，但綜合考慮儀器設備成本、試劑耗材成本、方法開發難易程度、操作簡便性及勞動強度、檢測通量等，實時熒光PCR法仍是目前臨床上人類基因組SNP檢測最重要的技術方法之一。

實時熒光PCR(Real-time PCR，RT-PCR)通過對PCR擴增反應中的每一個循環產物熒光信號的實時監測從而實現對起始模板的定性及定量分析。根據檢測原理的不同，實時熒光PCR法可分為探針法和非探針法兩種，分別利用的是與靶序列特異雜交的探針和熒光染料對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，并結合相應的軟件對產物進行分析。

熒光染料法是在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，該染料只與雙鏈DNA小溝結合，并不與單鏈DNA鏈結合，而且在游離狀態不發出熒光，只有摻入DNA雙鏈中才可以發光，因此，在PCR體系中，隨著特異性PCR產物的指數擴增，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。最常用的熒光染料有SYBR Green I、EvaGreen等。染料法經濟實惠，可以做溶解曲線，缺點是特異性差，溶解曲線分辨率相對較低，只能區分特異性的產物，很難分辨單堿基的差異。

熒光標記探針法是在PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，Taqman探針利用PCR擴增時Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解釋放熒光信號，分子信標探針則是利用獨特設計的發卡結構(莖環結構)的“結合-伸展”的結構改變完成熒光信號的釋放，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，隨著擴增的進行，實現了熒光信號的累積。

探針法通過探針可以提高收集信號的特異性，只有探針結合的片段上發生擴增才能收集到信號，探針法還適用于進行多重反應，能夠預測和提前進行反應條件的優化，靈敏度高，操作簡單，儀器設備易普及且適合各種通量，缺點則是合成熒光探針價格昂貴，且每個SNP位點需設計兩個等位基因的特異性探針，研發階段成本較高。因此，開發一種具有探針法高靈敏度且成本相對低廉的新的SNP檢測方法有著重要的意義。