[發明專利]一種α-1,3-葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制備中的應用

在審

• 申請號: 202110242462.4
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN113046284A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 吳敬;夏偉;畢然;黃燕
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/12;C12P19/00;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種α?1,3?葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制備中的應用，屬于基因工程和發酵工程技術領域。本發明將來源于Thermoplasmaacidophilum的α?1,3?葡萄糖苷酶在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了異源表達，將所述α?1,3?葡萄糖苷酶TaAglA以10％葡萄糖和20％麥芽糖為底物，黑曲霉低聚糖產量最高能達到88.5g/L，轉化率為29.5％。以10％麥芽糖和10％麥芽糊精為底物，黑曲霉低聚糖產量最高能達到47.4g/L，轉化率為23.7％。本發明制備得到的黑曲霉低聚糖(NOS)產量遠高于現有技術，并且能以較低濃度的底物進行轉化，同樣獲得了較高的黑曲霉低聚糖(NOS)轉化率和產量，有利于拓寬黑曲霉低聚糖的底物范圍和降低生產成本。

技術領域

本發明涉及一種α-1,3-葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制備中的應用，屬于基因工程和發酵工程技術領域。

背景技術

黑曲霉低聚糖(Nigerooligosaccharides，NOS)是一類含有α-1,3鍵的α-D-葡萄糖寡聚物，由于這種糖最早在日本的發酵清酒中被發現有少量存在，又稱Sakebiose，其成分主要包括黑曲霉二糖、黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖和黑曲霉糖基麥芽糖等。與其他低聚糖相比，黑曲霉低聚糖具有特殊醇香風味、低黏度、低甜度(約是蔗糖的45％)等特點，是清酒、豆醬等發酵型產品具有特殊的良好口感的主要原因。它可代替砂糖加入各種飲料中以增加厚味，降低高甜度甜味劑的異味、苦味，同時具有協調咸味和在低鹽下保持與增強鮮味的效果，對以鮮味為主體的各種飲料食品有味質調節效果。此外，黑曲霉低聚糖還具備預防齲齒、促進雙歧桿菌增殖調節腸道健康、改善脂質代謝等生理功效，以及使T淋巴球和B淋巴球等免疫細胞活性化的免疫激活作用。

黑曲霉低聚糖的生產方法主要有化學合成、多糖水解法和酶催化轉糖苷法3種。α-葡萄糖苷酶催化的葡萄糖基轉移反應是食品工業生產低聚異麥芽糖和黑曲霉低聚糖的重要反應，GH31家族α-葡萄糖苷酶是具有高轉苷活性的一類α-葡萄糖苷酶，但目前該家族α-葡萄糖苷酶的應用研究主要集中于催化合成α-1,6糖苷鍵制備低聚異麥芽糖方面，對α-1,3糖苷鍵具有高度選擇性的α-葡萄糖苷酶報道較少。目前已報道的具有α-1,3糖苷鍵合成能力的α-葡萄糖苷酶主要來源于真菌，如Acremoniun sp.S4G13分泌轉化酶以麥芽糖為底物催化制備黑曲霉低聚糖的轉化率可達37％，但其糖漿產品整體濃度僅20g/L(NOS約7.4g/L)，生產效率較為低下，且合成產物主要為黑曲霉二糖和黑曲霉糖基麥芽糖，而黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖以及DP≥4的黑曲霉糖基麥芽低聚糖則含量較低。本發明的目的在于利用一種細菌來源的α-1,3-葡萄糖苷酶提高黑曲霉低聚糖的產量及轉化率，同時提升所制備黑曲霉低聚糖組分中黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖的含量比例。

發明內容

α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)可催化麥芽低聚糖、異麥芽糖、α-葡聚糖等底物的非還原末端釋放α-D-葡萄糖，或通過轉糖基作用將葡萄糖基從供體底物轉移至糖基受體生成低聚糖或糖苷衍生物。

本發明提供了一種重組大腸桿菌，表達Thermoplasmaacidophilum來源的α-1,3-葡萄糖苷酶，所述α-1,3-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一種實施方式中，以pET24a為表達載體。

在一種實施方式中，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主。

本發明提供了一種制備黑曲霉低聚糖的方法，所述方法是利用氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的α-1,3-葡萄糖苷酶，或所述重組大腸桿菌表達的α-1,3-葡萄糖苷酶，以麥芽糖、葡萄糖或麥芽糊精中的一種或幾種為底物，合成黑曲霉低聚糖。

在一種實施方式中，以麥芽糖和葡萄糖的混合物為底物，麥芽糖的濃度為100-200g/L，葡萄糖的濃度為100-200g/L。

在一種實施方式中，麥芽糖和葡萄糖的濃度均為100g/L，或葡萄糖的濃度為100g/L、麥芽糖的濃度為200g/L。