[發明專利]一種檢測蜜蜂急性麻痹病毒的引物組和探針與應用及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110241403.5
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112853003A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 張體銀;李丹丹;王武軍;田國寧;張志燈;于師宇
• 申請（專利權）人: 福州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明涉及動物檢疫技術領域。本發明提供了一組能夠特異性檢測蜜蜂急性麻痹病毒的實時熒光RT?PCR的引物組和探針，并利用所述的引物組和探針對實時熒光RT?PCR的反應體系和反應程序進行優化得到的非診斷目的的檢測方法。本發明的檢測方法具有以下優點：(1)靈敏度高：本方法檢測限達到9.8拷貝/μL；(2)特異性強：對蜜蜂急性麻痹病毒的檢測具有高度特異性，與其它蜜蜂病毒無交叉反應，且重復性好；(3)操作簡單、快速：整個反應約50分鐘即可完成；(4)本發明可用于非診斷目的的蜜蜂急性麻痹病毒的檢測及其與其他蜜蜂病毒病的鑒別，對于保障我國養蜂業和維護自然生態的健康發展具有重要意義。

技術領域

本發明涉及動物檢疫技術領域，尤其涉及一種檢測蜜蜂急性麻痹病毒的引物組和探針與應用及其檢測方法。

背景技術

蜜蜂急性麻痹病毒(Acute bee paralysis virus，ABPV)是Bailey等在進行蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus，CBPV)傳染性試驗時發現的，當時蜜蜂感染ABPV后很快就會死亡，而感染后者則能存活數天，存在明顯的區別，目前該病在世界范圍內廣泛流行。ABPV主要感染西方蜜蜂，不同發育階段的蜜蜂均能感染，蜜蜂被感染后很快會出現麻痹癥狀，無法飛行，然后1～2天后死亡。ABPV除了能感染西方蜜蜂外，還能感染巴西蜜蜂，且感染率可達100％，另外還可以感染多個熊蜂蜂種，對蜂類帶來的危害不容小覷。ABPV一般情況下并不引起明顯的發病癥狀，多數呈隱性感染，但是當和狄斯瓦螨協同感染時，可導致蜜蜂的大批死亡，而且瓦螨還是ABPV的傳播媒介，病毒通過狄斯瓦螨吸食蜜蜂時進入到寄主體內的血淋巴中，然后在蜂群中迅速傳播。

常見的動物疾病診斷技術包括臨床診斷、顯微鏡形態學觀察、免疫學的ELISA抗體檢測技術和病原核酸檢測技術。由于蜜蜂病毒病的隱性感染，典型的發病癥狀并不多見，無法通過臨床癥狀進行診斷，而且一旦出現明顯的癥狀，疫病已經無法控制。ELISA檢測技術由于靈敏度高等優點多被用于抗體的檢測，但是由于蜜蜂病毒間具有高度的基因同源性，如ABPV和以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysisvirus，IAPV)同源相似性達65％、ABPV和蜜蜂克什米爾病毒(Kashmir bee virus，KBV)同源相似性達67％，容易發生交叉反應，特異性不強，使得這一技術無法用于檢測蜜蜂病毒進一步推廣應用。實時熒光PCR技術由于靈敏度高、特異性強、簡捷、快速等優點，已成為病原體檢測的首選方法。

目前，針對ABPV的實時熒光PCR檢測方法，現有技術報道的主要有Kukielka等建立的雙重實時熒光RT-PCR方法，可以同時檢測SBV和ABPV，但靈敏度只有389拷貝/μL；等建立的TaqMan探針RT-PCR，靈敏為44拷貝/μL；Kim等建立的巢式超快速PCR方法，整個擴增過程也需要將近1h左右，但靈敏度又有所降低，最低檢測限只有100拷貝/μL。這樣的靈敏度不能更準確的檢測到蜜蜂的ABPV病毒。因此，現有技術中急需一種特異性更強，敏感度更高的檢測蜜蜂ABPV的引物組和探針及其檢測方法來彌補現有技術的不足，來保障我國養蜂業和自然生態的健康發展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種特異性更強，靈敏度更高的檢測蜜蜂急性麻痹病毒的引物組和探針應用于檢測ABPV，來保障我國養蜂業和自然生態的健康發展。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種檢測蜜蜂急性麻痹病毒的引物組和探針，包括上游引物ABPV-F、下游引物ABPV-R及TaqMan探針ABPV-P；所述上游引物ABPV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物ABPV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探針ABPV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。

作為優選，所述TaqMan探針ABPV-P的5'端采用熒光基團ROX進行修飾，3'端采用BHQ1進行修飾。