[發明專利]一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法

在審

• 申請號: 202110239910.5
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112852676A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 趙亮;吳明華;許劍;錢程
• 申請（專利權）人: 江蘇永盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/18;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 蘇州國卓知識產權代理有限公司 32331
• 代理人: 劉靜宇

本發明公開了一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法，包括以下操作步驟：產細菌素菌株的發酵肉樣品的篩選：發酵肉制品是產細菌素菌株的重要來源之一，在無菌環境下，將肉制品樣品切碎并置于絞肉機中絞碎，取樣品加到無菌生理鹽水的三角瓶中，充分震蕩，靜置后取懸液加到MRS液體培養基中。本發明所述的一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法，通過管碟法對采集的樣品進行抑菌實驗的檢測，將此樣品作為產細菌素菌株篩選以及關于細菌素后續研究的對象展開后續實驗，從宏觀方面來篩選，即首先篩選含有產細菌素乳酸菌的樣品，再分離產細菌素的菌株，這樣有目的性的分離篩選將提高效率，縮短菌株篩選的周期，帶來更好的使用前景。

技術領域

本發明涉及產細菌素菌株鑒定領域，特別涉及一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法。

背景技術

產細菌素的菌株主要存在于發酵肉制品、乳制品等多種食品中。其中，發酵肉制品是產細菌素菌株的重要來源之一。該細菌素普遍具有安全性高、抑菌專一性強、pH穩定性和熱穩定性高等優勢，隨著科技的不斷發展，人們對于產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法要求也越來越高。

現有的產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法在使用時存在一定的弊端，傳統產細菌素乳酸菌的篩選都是先從樣品中篩選得到乳酸菌，再通過檢測乳酸菌的發酵上清的抑菌活性來判斷是否具有產細菌素的能力，降低工作效率，不利于人們的使用，給人們的使用過程帶來了一定的不利影響，為此，我們提出一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法，通過管碟法對采集的樣品進行抑菌實驗的檢測，將此樣品作為產細菌素菌株篩選以及關于細菌素后續研究的對象展開后續實驗，從宏觀方面來篩選，即首先篩選含有產細菌素乳酸菌的樣品，再分離產細菌素的菌株，這樣有目的性的分離篩選將提高效率，縮短菌株篩選的周期，可以有效解決背景技術中的問題。

(二)技術方案

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法，包括以下操作步驟：

S1：產細菌素菌株的發酵肉樣品的篩選：發酵肉制品是產細菌素菌株的重要來源之一，在無菌環境下，將肉制品樣品切碎并置于絞肉機中絞碎，取樣品加到無菌生理鹽水的三角瓶中，充分震蕩，靜置后取懸液加到MRS液體培養基中，置于恒溫培養箱中，將培養好的菌液離心去沉淀，用L-1NaOH溶液將上清調至pH 6.0左右，用管碟法抑菌實驗檢驗上清有否有抑菌效果；

S2：產細菌素菌株的樣品中乳酸菌的分離純化：在無菌環境下，將含產細菌素菌株的肉制品切碎并置于絞肉機中絞碎，取樣品加到含有無菌生理鹽水的三角瓶中，充分震蕩，靜置后即為YS01的懸液，另取裝有9mL無菌水試管5支，吸取已稀釋成YS01的懸液1mL加入無菌生理水的試管中，并震蕩使之充分混勻，即成10-2稀釋液，同法依次10倍連續稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7，取各個梯度的稀釋液1mL至無菌平皿中，取已熔化的MRS固體培養基倒入平皿中，凝固后，倒置恒溫培養，平板培養后，根據菌落形態、大小、顏色、培養基中生長位置，表面、內部、及底部，用接種環挑取不同表觀特征菌落接種于MRS液體培養基中，置于恒溫培養箱中培養，將培養好的菌株以10倍系列梯度稀釋，選擇合適的稀釋度，取1mL菌液加入平皿中，用含有碳酸鈣的MRS培養基倒平板，凝固后，倒置恒溫培養，挑取具有溶鈣圈的菌落進行接種培養，并用革蘭氏染色進行鏡檢，記錄存檔，用甘油脫脂乳將純化好的乳酸菌保藏于-20℃，以待后續實驗所用；

S3：產細菌素乳酸菌的初篩：將S2步驟中分離出來的乳酸菌菌株進行活化，按1％的接種量將其接種于MRS液體培養基中，于37℃恒溫培養箱中培養12-16h，再以同樣的方法活化第二代，之后接種第三代并于37℃培養箱中培養24h，將培養好的菌液進行離心，并去上菌體沉淀，用L-1NaOH溶液將上清調至pH6.0左右，用S1步驟中所述管碟法檢測乳酸菌株的發酵上清是否具有抑菌活性；