[發明專利]一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法

在審

• 申請號: 202110239910.5
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112852676A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 趙亮;吳明華;許劍;錢程
• 申請（專利權）人: 江蘇永盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/18;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 蘇州國卓知識產權代理有限公司 32331
• 代理人: 劉靜宇

1.一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法，其特征在于：包括以下操作步驟：

S1：產細菌素菌株的發酵肉樣品的篩選：發酵肉制品是產細菌素菌株的重要來源之一，在無菌環境下，將肉制品樣品切碎并置于絞肉機中絞碎，取樣品加到無菌生理鹽水的三角瓶中，充分震蕩，靜置后取懸液加到MRS液體培養基中，置于恒溫培養箱中，將培養好的菌液離心去沉淀，用L-1NaOH溶液將上清調至pH 6.0左右，用管碟法抑菌實驗檢驗上清有否有抑菌效果；

S2：產細菌素菌株的樣品中乳酸菌的分離純化：在無菌環境下，將含產細菌素菌株的肉制品切碎并置于絞肉機中絞碎，取樣品加到含有無菌生理鹽水的三角瓶中，充分震蕩，靜置后即為YS01的懸液，另取裝有9mL無菌水試管5支，吸取已稀釋成YS01的懸液1mL加入無菌生理水的試管中，并震蕩使之充分混勻，即成10-2稀釋液，同法依次10倍連續稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7，取各個梯度的稀釋液1mL至無菌平皿中，取已熔化的MRS固體培養基倒入平皿中，凝固后，倒置恒溫培養，平板培養后，根據菌落形態、大小、顏色、培養基中生長位置，表面、內部、及底部，用接種環挑取不同表觀特征菌落接種于MRS液體培養基中，置于恒溫培養箱中培養，將培養好的菌株以10倍系列梯度稀釋，選擇合適的稀釋度，取1mL菌液加入平皿中，用含有碳酸鈣的MRS培養基倒平板，凝固后，倒置恒溫培養，挑取具有溶鈣圈的菌落進行接種培養，并用革蘭氏染色進行鏡檢，記錄存檔，用甘油脫脂乳將純化好的乳酸菌保藏于-20℃，以待后續實驗所用；

S3：產細菌素乳酸菌的初篩：將S2步驟中分離出來的乳酸菌菌株進行活化，按1％的接種量將其接種于MRS液體培養基中，于37℃恒溫培養箱中培養12-16h，再以同樣的方法活化第二代，之后接種第三代并于37℃培養箱中培養24h，將培養好的菌液進行離心，并去上菌體沉淀，用L-1NaOH溶液將上清調至pH6.0左右，用S1步驟中所述管碟法檢測乳酸菌株的發酵上清是否具有抑菌活性；

S4：產細菌素乳酸菌的復篩：為排除抑菌物質為酸和H2O2的可能，并確定抑菌物質為蛋白質，將S3步驟中有效果的菌株以同樣的方法活化獲得發酵上清后，進行酸作用排除實驗、H2O2作用排除實驗與抑菌物質為蛋白質的確定實驗；

S5：產細菌素菌株的RAPD分析：對產細菌素菌株的DNA進行提取，將篩選出來的產細菌素的菌株進行活化，基于傳統法進行部分條件優化后提取DNA，從實驗室已有的7種隨機引物中篩選適合的引物：P1252、P1284、OPA-18、OPL-16、OPM-05、OPA-03、OPV-07，淘汰擴增效果較差，條帶模糊不清的引物，對擴增總條帶數多于5條且條帶清晰的引物用于再次篩選，從擴增后的電泳圖中選用多態性和擴增重復性好，譜帶清晰且較多的引物，用于產細菌素菌株DNA樣品的RAPD分析；

S6：產細菌素菌株的形態學及生理生化鑒定：主要分為培養特征鑒定、形態特征鑒定與生理生化特征鑒定；

S7：產細菌素菌株的16S rDNA鑒定：將S5步驟中提取好的目標菌株基因組DNA進行16SrDNA的PCR擴增，16SrDNA的PCR擴增反應中所用引物為通用引物，采用PCR對目的片段進行擴增，同時設置空白對照組，即用ddH2O代替擴增體系中的DNA模板，PCR結束后將PCR擴增產物置于4℃保存，取PCR擴增產物與溴酚蘭混勻后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，確定出現單一條帶，對其進切膠回收純化，測序，將測序所得結果于NCBI上進行BLAST比對，并利用對得出的結果構建系統發育樹；

S8：產細菌素菌株的毒力檢測：為了評估菌的潛在致病性，對其是否含一些毒力基因進行檢測，方法是對這些毒力基因進行PCR，需要檢測的毒力基因包括asa1，即聚集物、ace，即膠原蛋白黏附素、esp，即腸球菌表面蛋白、efaAfm，即細胞壁黏附素、cylA/B，即細胞溶素的活化和表達，其中不同引物的退火溫度不同，實驗中按照各自引物的退火溫度設置PCR程序，PCR結束后將PCR擴增產物置于4℃保存，取PCR擴增產物與溴酚蘭混勻后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，在自動凝膠成像儀中觀察、拍照記錄。

2.根據權利要求1所述的一種產細菌素菌株的分離篩選和檢測鑒定方法，其特征在于：所述的常用培養基的配制主要包括MRS培養基及BHI培養基。