[發明專利]基于基因編輯技術的GBSSI突變型蛋白及其在植物育種中的應用

在審

• 申請號: 202110239257.2
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112760304A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 張輝;汪沖;魏闖;賈萌
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/84;C12N15/55;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

1.一種水稻GBSSI突變型蛋白，其特征在于，所述GBSSI突變型蛋白的氨基酸序列存在以下突變：其對應于水稻GBSSI氨基酸序列的第178位氨基酸發生突變。

2.根據權利要求1所述的水稻GBSSI突變型蛋白，其特征在于，包括：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或

(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有直鏈淀粉合成酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

3.一種編碼權利要求1或2所述突變型蛋白的基因。

4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于：

a)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或

b)在嚴格條件下與a)限定的核酸序列雜交且編碼具有直鏈淀粉合成酶活性蛋白質的核酸序列。

5.表達盒、重組載體或細胞，其特征在于，所述表達盒、重組載體或細胞含有權利要求3或4所述基因。

6.權利要求1或2所述水稻GBSSI突變型蛋白在水稻育種中的應用。

7.獲得低直鏈淀粉含量的水稻的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)使水稻植株包含權利要求3或4所述的基因；或

2)使水稻植株表達權利要求1或2所述的水稻GBSSI突變型蛋白。

8.一種利用基因編輯技術低直鏈淀粉含量水稻的育種方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)設計Waxy基因定點編輯的靶位點：基因編輯的靶位點核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

2)構建含有目的片段的CRISPR/Cas9基因編輯載體：

A)靶點接頭制備：采用接頭引物用雙蒸水溶解成母液，母液稀釋后90℃30s(second，秒)，移至室溫冷卻完成退火，即獲得靶點接頭；所述引物為Waxy TXT-F和Waxy TXT-R，序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

B)將退火獲得的靶點片段連接到CRISPR/Cas9表達載體上獲得連接產物；

C)將步驟B)的連接產物進行熱激法轉化大腸桿菌獲得重組菌，提取通過驗證的含目的條帶的菌液的陽性質粒；

3)將陽性質粒轉化農桿菌EHA105，獲得T0代轉基因植株，以引物Waxy TXT-F和WaxyTXT-R對T0代轉基因植株進行擴增并測序鑒定獲得具備權利要求1或2所述突變型蛋白的植株。

9.根據權利要求8所述的育種方法，其特征在于，所述育種方法還包括將具有突變型蛋白的T0代轉基因植株的含有目標等位基因純合突變的T1代植株的T-DNA載體的剔除，所述T-DNA載體包括篩選標記HPT基因和Cas9元件。

10.根據權利要求9所述的育種方法，其特征在于，所述T-DNA載體的剔除通過對含有目標等位基因純合突變的T1代植株的HPT基因和Cas9元件同時檢測，重復多次，篩選得到不攜帶這兩個基因的T1代單株即為目標植株。