[發明專利]基于基因編輯技術的GBSSI突變型蛋白及其在植物育種中的應用

在審

• 申請號: 202110239257.2
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112760304A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 張輝;汪沖;魏闖;賈萌
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/84;C12N15/55;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明公開了水稻直鏈淀粉合成酶GBSSI突變型蛋白、其編碼基因及在育種中的應用，所述GBSSI突變型蛋白的氨基酸序列存在以下突變：其對應的水稻GBSSI氨基酸序列的第178位氨基酸發生突變，本發明還公開了利用基因編輯創制直鏈淀粉含量5％左右水稻的育種方法。本發明利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，對Waxy基因進行定點突變，通過后代篩選，在T1代可以獲得剔除Cas9元件的新材料，而新材料的基本農藝性狀與野生型相比無明顯改變。相對于傳統的化學誘變育種和雜交育種等手段，基因編輯定向改良分子育種技術具有高效、精準等優點，極大提高育種效率、加快育種進程。

技術領域

本發明涉及水稻遺傳育種、糯性品質改良鄰域，具體地，本發明涉及基于基因編輯技術的GBSSI突變型蛋白及其在植物育種中的應用。

背景技術

水稻是重要的糧食作物，隨著人們生活水平的提高，對優質水稻品種的需求進一步增大。水稻直鏈淀粉含量影響水稻糯性，進而影響稻米的品種和口感。高直鏈淀粉稻米的糊化溫度較高，膠稠度降低，煮成米飯的黏性、光澤度及柔軟性都比較差；低直鏈淀粉含量的稻米，煮成飯后米粒晶瑩、口感軟糯，從而備受人們青睞。因而，通過降低水稻中的直鏈淀粉含量從而來改善稻米品質一直以來是育種家的目標。

水稻中直鏈淀粉主要由水稻蠟質基因Waxy(Wx)編碼的顆粒結合淀粉合成酶(GBSSI)催化合成。研究表明Waxy是控制稻米直鏈淀粉含量的主效基因，目前大部分基于水稻品質的分子遺傳育種都是圍繞該基因進行的。在栽培稻中存在三個主要的Wx等位基因，Wx^a、Wx^b和wx。wx存在于糯稻品種中，是Wx基因的功能缺失形式，wx稻米中沒有直鏈淀粉或者直鏈淀粉含量非常低(小于2％)。Wx^a等位基因存在于大多數秈稻品種中，而大多數粳稻品種含有Wx^b等位基因。這兩個等位基因之間的主要差異是G/T多態性，該多態性產生的差異剪接會影響Wx mRNA穩定性，導致Wx^a等位基因產生的mRNA和蛋白質水平比Wx^b高10倍，從而使秈稻產生更多的直鏈淀粉(一般大于25％，有的在30％以上)，而粳稻中直鏈淀粉含量一般為15-18％。除了這三個等位基因，近年來通過對一些自然存在的一些直鏈淀粉含量變化的品種的研究，也發現了其它一些復等位基因，如Wxⁱⁿ、Wx^op、Wx^mq及Wx^mp等。這些等位基因一般在序列上有一個或幾個堿基的差異，這些差異會影響Wx基因的表達及GBSS的活性，從而導致直鏈淀粉含量及稻米品質的不同。

通過傳統的育種方法也可以這些優良性狀轉育到當地品種中，但這種方式耗時、費力、不確定因素較多，很難在短期內對本地品種進行改良。因而需要發展新的技術和方法來加速優良品種的培育。近年來，基因編輯技術，特別是CRISPR/Cas9技術的出現，為快速培育優良新品種提供了可能。本發明通過CRISPR/Cas9技術對水稻Waxy基因進行了人工突變，并獲得了直鏈淀粉含量5％左右的新材料，為水稻新品種改良提供基礎材料。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種水稻GBSSI突變型蛋白，所述GBSSI突變型蛋白的氨基酸序列存在以下突變：其對應于水稻GBSSI氨基酸序列的第178位氨基酸發生突變。

本發明首次發現了該178位氨基酸由蘇氨酸突變為異亮氨酸并改變稻米直鏈淀粉含量。本發明的第178位氨基酸的突變還可以包括谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、天冬氨酸、色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸以及終止密碼子等19種變異類型。而關于上述的氨基酸的其他變異或提前終止是否影響淀粉合成酶活性、生理功能以及是否改變稻米直鏈淀粉含量，還有待進一步研究證實。

進一步地，本發明所述的水稻GBSSI突變型蛋白，其特征在于，包括：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或