[發明專利]一種牛源性成分的LAMP檢測方法

在審

• 申請號: 202110239002.6
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112795665A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 楊立桃
• 申請（專利權）人: 上海交通大學蘇北研究院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844
• 代理公司: 寧波華拓同億專利代理事務所(普通合伙) 33432
• 代理人: 南夢怡

本發明公開了一種牛源性成分的LAMP檢測方法，包括以下步驟：a)設計合成引物；所述引物由上游內部引物FIP、下游內部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3組成，所述引物的堿基序列如SEQ ID No：1～4；b)制備牛屬北美野牛、奶牛、牦牛、水牛的DNA稀釋液；c)配制LAMP反應體系并設定反應條件；d)進行LAMP方法特異性檢測；e)進行LAMP方法靈敏度檢測。本發明建立的方法具有快速、高效、靈敏、準確等優點，在動物源性成分食品監管和檢驗檢疫工作中有實際應用價值，尤其適用于基層實驗室和現場檢測的推廣和應用。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及動物源性成分特異性的檢測方法，具體涉及LAMP方法檢測牛源性成分的引物和方法。

背景技術

由于價格、宗教、健康等原因，許多國家要求肉類及其制品類的食品標簽必須真實明確地標出肉類來源，禁止摻假行為，以保護消費者的利益，但是市場上混淆肉類品種的現象仍然非常普遍，主要是在高價肉類中摻雜低價肉類，如牛肉、羊肉中摻雜豬肉、鴨肉等。2013年，在瑞典、英國和法國部分牛肉制品中發現了馬肉，德國也宣布發現疑似此類情況，引發了消費者強烈反感，歐盟要求所有成員國對加工牛肉制品開展DNA抽檢，以消除對“馬肉風波”的憂慮。因此建立快速、準確的食品動物源成分安全檢測技術，能夠為消費者利益和生命安全提供技術保障。

動物源性成分的鑒定方法主要包括蛋白質鑒定(放射免疫法、色譜法等)和分子生物學鑒定(PCR方法等)兩大類。應用蛋白質鑒定方法時，當肉類經過切碎、蒸煮、熏烤等加工過程后，肉中蛋白質結構通常被破壞，物種特有的蛋白質或抗原決定部位也遭到破壞。所以，通過蛋白質鑒定方法鑒別肉類品種的可靠性較差。相比之下，檢測DNA的鑒定方法更可靠，因為DNA在所有組織細胞中都一樣，不用考慮DNA是從肌肉、脂肪還是其他組織中提取的。由于分子生物學鑒定中的PCR法反應時間短，具有較高的靈敏度、特異性和可操作性，目前已成為肉制品種屬鑒別最常用的方法，但普通PCR法擴增后需要凝膠電泳進行結果分析，所用染液EB為強致癌物質，因此存在一定的操作安全隱患，并且還存在非特異性擴增導致的假陽性問題。常規的動物源性成分的檢測主要采用普通PCR方法和TaqMan實時熒光定量PCR方法。普通PCR方法由于操作繁瑣、耗時長、易污染環境等缺點已逐漸被TaqMan實時熒光定量PCR取代。TaqMan實時熒光定量PCR靈敏度高、特異性好，但需昂貴的熒光PCR儀和配套的試劑，不能普遍適用于檢驗檢疫一線的基層實驗室和現場檢測。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本學者Notomi研發的基因診斷技術，該方法針對目的基因的6個區段設計引物，提高了檢測的特異性，同時該方法的擴增效率較普通PCR高，很大程度地提高了靈敏度。因此可以應用該技術嘗試實現多靶標的動物源性成分的現場快速檢測，而不需要依賴額外復雜的實驗設備及其他條件，有很大的實際應用前景。

LAMP技術以其特異性強、靈敏度高、快速、準確和操作簡便等優點，現已應用于致病微生物、病毒、寄生蟲的鑒定，轉基因和動物源成分檢測等多方面。目前對于這一技術的運用有對于微生物病原體的檢驗上，如大腸桿菌、沙門氏菌、分支桿菌、口蹄疫病毒等。Denschlag等人用該技術檢測了致突鐮刀菌的Hyd5，Qingchao Li等驗證了應用LAMP技術轉基因水稻中的cry1Ab基因優于qPCR方法，劉少寧等建立了一種能夠快速區分出綿羊肉中摻入狐貍源性成分的環介導等溫擴增方法，徐淑菲等根據羊cytB基因設計特異性引物，動物GenieⅡ等溫擴增熒光檢測系統，建立了檢測羊源性成分的LAMP方法。目前關于動物源性成分LAMP檢測技術的應用多數是針對單靶標檢測的，且大部分方法是基于線粒體DNA靶序列的，而同一細胞中線粒體的拷貝數不定，該技術的高靈敏度可能會導致無論反應工作與否都得到陽性結果，因此有必要建立基于牛屬共有基因組DNA序列的LAMP檢測方法。

但是，目前依然尚無關于LAMP方法檢測牛源性成分的報道或者專利。因此有必要建立對牛源性成分的LAMP檢測技術。

發明內容