[發明專利]一種谷氨酸脫羧酶及γ-氨基丁酸高產菌株

有效

• 申請號: 202110238958.4
• 申請日: 2021-03-04
• 公開（公告）號: CN112831488B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 方海田;張恒;劉慧燕;潘琳;趙春光
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物工程領域，涉及一種酶活及穩定性提高的谷氨酸脫羧酶，以及高密度發酵生產γ?氨基丁酸的方法。所述谷氨酸脫羧酶突變體，是在SEQ ID NO.1所示的來源于大腸桿菌MG1655的野生型谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的基礎上，發生T62S或Q309A突變所得，酶活較野生型提高4?13％，pH穩定性較野生型提高6?10％，溫度穩定性較野生型提高19?27％。同時過表達上述突變體編碼基因的大腸桿菌重組菌生產γ?氨基丁酸的能力也穩步提升，具有較高的生產應用價值。

技術領域：

本發明公開一種酶活及穩定性提高的谷氨酸脫羧酶，以及高密度發酵生產γ-氨基丁酸的方法，屬于生物工程領域。

背景技術：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種極易溶于水的非蛋白質氨基酸，被廣泛應用于食品和制藥工業中，市場需求量極大?？赏ㄟ^化學合成法、植物富集法、生物轉化法和微生物直接發酵法生產。

化學合成法常見的原料如下：鄰二甲苯和γ-氯丁氰或丁內酯、吡咯烷酮和氯化鈣及碳酸氫銨、丁酸和氨水、丙氨和甲酸、溴醋酸甲酯和乙烯?；瘜W合成GABA的產量相對較高，但這一系列操作過程較繁瑣，設備成本高，且生產所用化學試劑對人體有害，安全性差，難以控制，很難實現工業化的生產。因此，化學合成法生產GABA的工藝還需要改進。

植物富集法生產GABA如下：第一種方法利用了植物GABA支路途徑中的谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD),它可將谷氨酸α-脫羧生成GABA和CO₂。第二種方法利用了植物的多胺降解途徑，此途徑以多胺為底物，經GAD、二胺氧化物、多胺氧化物等物質的催化，生成GABA。植物富集法相對于化學合成法操作簡單、安全性好。但是其生產效率低，分離難度大，獲得的GABA含量少，從而使得生產成本較高。

微生物直接發酵法是指利用具有產GABA能力的菌株，在滿足菌株正常生長的營養環境中，發酵生成GABA的方法。在這個過程中，利用了微生物具有合成自身所需GABA的能力，即利用了微生物的代謝調控機制。直接通過發酵生產GABA，周期比較長，且不同菌株的遺傳特性不同，產GABA的能力也有差距，在后期的分離提純環節中，操作較為繁瑣。

生物轉化法是指微生物在代謝過程中產生的一類或一系列酶對底物的催化或修飾反應。即在GABA的生產中，底物利用酶的催化作用，直接生成GABA。這種生產方法具有可選擇的微生物種類多、酶系豐富、特異選擇性高、條件溫和、轉化率高、污染小、分離提純方便等優點。隨著現代生物技術的發展，理性改造和半理性改造為培育出更多性能優越的GABA生產菌株提供了新思路。

大腸桿菌是很早確定了的具有產GABA能力的菌株，所以利用大腸桿直接發酵生產比較成熟。而直接發酵生產GABA的原理是，谷氨酸脫羧酶在依賴于輔酶磷酸吡哆醛(PLP)的情況下，催化L-谷氨酸脫去羧基，釋放出一分子CO₂，進而得到GABA。在自然界中，各種菌種因谷氨酸脫羧酶活性的不同，他們產GABA的能力也有著很大區別。其次，將篩選好的大腸桿菌用于直接發酵，環境因素也會影響大腸桿菌細胞的生長，進而影響GABA的產量，加之野生菌株的不穩定性，就很難控制直接發酵過程中的發酵條件。隨著生物技術的發展，利用大腸桿菌生物法高效合成GABA的技術得到重視。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明通過將大腸桿菌(Escherichia coli)K-12MG1655來源的谷氨酸脫羧酶(以下簡稱GAD)進行定點突變，獲得兩個酶活及穩定性提高的谷氨酸脫羧酶，且用定點突變菌株進行高密度發酵時，γ-氨基丁酸的比生產速率顯著提高，為擴大及穩定生產GABA提供了參考。

本發明提供的技術方案之一，是一種谷氨酸脫羧酶突變體，是在SEQ ID NO.1所示的來源于大腸桿菌MG1655的野生型谷氨酸脫羧酶氨基酸序列的基礎上，發生第62位氨基酸突變-T62S或第309位氨基酸突變-Q309A所得(以下簡稱T62S突變體或Q309A突變體)；