[發明專利]用于檢測諾如病毒GI型和GII型恒溫擴增的引物組、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202110237205.1
• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112760423B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 曹際娟;鄭秋月;楊莉莉;樸永哲;胡冰
• 申請（專利權）人: 大連民族大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京嘉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11687
• 代理人: 楊波

1.一種非診斷目的的用于檢測諾如病毒GI型和GII型恒溫擴增的熒光檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S1、從樣品中提取RNA；

步驟S2、對所述RNA進行恒溫擴增；其中，在反應體系中，采用用于檢測諾如病毒GI型和GII型恒溫擴增的引物組，所述引物組包括諾如病毒GI型引物組和諾如病毒GII型引物組；其中，所述諾如病毒GI型引物組包括SEQ ID NO.1所示的外引物GI-OF、SEQ ID NO.2所示的外引物GI-OB、SEQ ID NO.3所示的內引物GI-IF、SEQ ID NO.4所示的內引物GI-IB、SEQ IDNO.5所示的環引物GI-LF和SEQ ID NO.6所示的環引物GI-LB；所述諾如病毒GII型引物組包括SEQ ID NO.7所示的外引物GII-OF、SEQ ID NO.8所示的外引物GII-OB、SEQ ID NO.9所示的內引物GII-IF、SEQ ID NO.10所示的內引物GII-IB、SEQ ID NO.11所示的環引物GII-LF和SEQ ID NO.12所示的環引物GII-LB；

步驟S3、結果判定：

若有“S”型熒光信號擴增曲線，Ct值35，則判斷為陽性；

若無“S”型熒光信號擴增曲線，無Ct值或Ct值45則判斷為陰性；

若Ct值在35-45之間，重復實驗，若Ct值45，熒光信號擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性；

在步驟S2中，所述恒溫擴增的反應體系體積為25μL，其中，所述反應體系中包括以下終濃度的反應混合物：1×RNA恒溫擴增反應緩沖液、2×SYBR Green I、0.32U/μL Bst DNA聚合酶、0.04U/μL AMV逆轉錄酶、0.2μM外引物OF、0.2μM外引物OB、1.6μM內引物IF、1.6μM內引物IB、0.8μM環引物LF和0.8μM環引物LB。

2.根據權利要求1所述的熒光檢測方法，其特征在于，在步驟S2中，所述恒溫擴增的反應體系總體積為25μL，其中，所述反應體系中包括2×RNA恒溫擴增反應緩沖液12.5μL、100×SYBR Green I 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、5U/μL AMV逆轉錄酶0.2μL、引物組1μL、樣品RNA模板2.0μL、其余為去核酸的超純水補足25μL。

3.根據權利要求2所述的熒光檢測方法，其特征在于，所述引物組1μL包括5μM外引物OF、5μM外引物OB、40μM內引物IF、40μM內引物IB、20μM環引物LF和20μM環引物LB。