[發明專利]誘導人類多能干細胞定向內皮分化方法

有效

• 申請號: 202110235774.2
• 申請日: 2021-03-03
• 公開（公告）號: CN112980770B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 董念國;謝明輝;程敏;喬韡華;曹紅;嚴格
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 武漢泰山北斗專利代理事務所(特殊普通合伙) 42250
• 代理人: 程千慧

本發明涉及一種誘導人類多能干細胞定向內皮分化方法，具體包括以下步驟：1、人類誘導多能干細胞達到80％融合以上時，使用含有10?50ng/ml WNT3a的分化培養基，對消化后的干細胞進行誘導分化；2、使用含有10?50ng/ml WNT3a和10?30ng/ml BMP2的分化培養基，對細胞繼續誘導分化；3、使用含有10?30ng/ml BMP2的分化培養基，對步驟2誘導分化后的細胞繼續誘導分化為中胚層細胞；4、使用含有10?15ng/ml FGF8的培養基，對細胞繼續誘導分化為內皮細胞。本發明通過改良培養基及相關細胞因子，本實驗方案可以具備更高的內皮誘導效率。

技術領域

本發明涉及誘導人類多能干細胞的定向分化領域，具體涉及一種誘導人類多能干細胞定向內皮分化方法。

背景技術

心血管疾病(CVD)通常由內皮功能障礙引發，是世界上主要的死亡原因之一。由于缺乏分離足夠數量的功能正常的自體內皮細胞(ECs)移植的方法，以及我們對內源性ECs在各種心血管疾病發生過程中如何功能失調的了解有限，直接通過內皮替代治療CVD受到阻礙。人類誘導多能干細胞(HiPSCs)的創新，即從體細胞重新編程為類似胚胎干細胞(ESC)的多潛能狀態的細胞，可以產生大量針對患者的EC，可用于移植、藥物篩選或研究，以探索某些疾病狀態下內皮功能障礙的機制。然而，目前大多數的內皮分化方案分化效率低下，分化的細胞異質性較大，一定程度上限制了HiPSCs來源的內皮細胞的應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述問題，提供一種誘導人類多能干細胞定向內皮分化方法，本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

誘導人類多能干細胞定向內皮分化方法，包括以下步驟：

步驟1、第0-1天：人類誘導多能干細胞達到80％融合以上時，使用含有10-50ng/mlWNT3a和1μmol/L SU5402的RPMI/B27分化培養基，對消化后的人類誘導多能干細胞進行誘導分化；

步驟2、第1-2天：使用含有10-50ng/ml WNT3a、10-30ng/ml BMP2和1μmol/LSU5402的RPMI/B27分化培養基，對步驟1誘導分化后的細胞繼續誘導分化；

步驟3、第2-3天：使用含有10-30ng/ml BMP2和1μmol/L SU5402的RPMI/B27分化培養基，對步驟2誘導分化后的細胞繼續誘導分化為中胚層細胞；

步驟4、第4-9天:使用含有30-50ng/ml VEGF、10-15ng/ml FGF8和10-15ng/mlbFGF的EGM-2/B27培養基，對步驟3誘導分化后的細胞繼續誘導分化為內皮細胞。

進一步的，所述步驟2和步驟3中分化培養基中WNT3a的濃度為10ng/ml，BMP2的濃度為10ng/ml。

進一步的，所述步驟4的培養基中FGF8的濃度為10ng/ml。

本發明的有益效果為：通過改良培養基及相關細胞因子，本實驗方案可以具備更高的內皮誘導效率。

附圖說明

圖1為中胚層標志物CD15的流式細胞圖；

圖2為內皮標志物CD31、CD144雙標流式細胞圖；

圖3為內皮標志物單標CD144流式細胞圖；

圖4為內皮標志物單標CD31流式細胞圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

誘導人類多能干細胞定向內皮分化方法，包括以下步驟：

HiPSCs的維持