[發(fā)明專利]一種利用流式細(xì)胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110234932.2
• 申請(qǐng)日: 2021-03-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112980795A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋興輝;楊堯順;王琳琳;李艷偉;邢月婷;王佳佳;黃瑩瑩;郭春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;G01N15/14
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 何碧珩;卓彩霞

本發(fā)明公開(kāi)了一種利用流式細(xì)胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，包括使用流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行外泌體分選，使用50μm空氣噴射噴嘴，鞘液的壓力為75?80.5psi，樣品流的壓力與鞘液的壓力差值為0.3?0.6psi；閾值設(shè)置為0.01；利用聚苯乙烯珠，標(biāo)定粒徑為50nm、100nm、200nm和500nm的外泌體顆粒的位置；利用流式細(xì)胞儀分離純化50?200nm粒徑的外泌體顆粒。本發(fā)明的方法能夠得到50?200nm的外泌體，粒徑范圍更小，不含其他粒徑范圍，純度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于納米生物顆粒獲取領(lǐng)域，具體涉及一種利用流式細(xì)胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞釋放出不同大小的細(xì)胞外囊泡(EVs)，因其運(yùn)載的信號(hào)分子及膜內(nèi)含物在細(xì)胞間通訊發(fā)揮了重要作用，越來(lái)越受到研究者的重視。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Exosomes andEctosomes in Intercellular Communication；2019 cell-Reassessment of ExosomeComposition)，大小不同的外囊泡的作用也不同，其中50-150nm由內(nèi)小體(Exosomes)衍生的小胞外囊泡(SEVS)可以精確地將RNA、DNA和蛋白質(zhì)分配到正確的細(xì)胞外，并確定它們的分泌機(jī)制，對(duì)于識(shí)別生物標(biāo)志物和設(shè)計(jì)未來(lái)的藥物干預(yù)措施至關(guān)重要。

另外，粒徑、濃度等物理參數(shù)，是評(píng)估外泌體分離的主要指標(biāo)之一，隨著外泌體在臨床應(yīng)用的不斷研究，對(duì)外泌體分離方法及檢測(cè)手段提出了更高的要求。

目前常用的分離方法有超速離心法、尺寸排阻法及聚合物沉淀法等，但不同分離純化方法得到的外泌體粒徑參數(shù)不一致。已有文獻(xiàn)表明，超速離心法提取的外泌體顆粒主要在40-500nm之間，粒徑大小均有分布；尺寸排阻法提取的外泌體顆粒主要在40-120nm之間，以小粒徑顆粒居多；聚合物沉淀法提取的外泌體主要分布在40-100nm之間，只有極少數(shù)分布在100nm以上，大粒徑的顆粒較少。以上方法均無(wú)法獲取50-200nm之間(含50-150nm)的小胞外囊泡，一定程度上影響下游實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，因此純化分離特定粒徑區(qū)間的外囊泡是亟待解決的問(wèn)題。

流式細(xì)胞儀能夠?qū)?xì)胞及細(xì)胞大小的生物顆粒進(jìn)行定量表征，入射激光束逐個(gè)照射液流系統(tǒng)中的細(xì)胞或顆粒，由高靈敏度檢測(cè)器接收散射光及其他熒光信號(hào)后，完成多參數(shù)分析，例如顆粒的形狀及大小。對(duì)于相同折射率的顆粒及其懸浮介質(zhì)，其散射光通常與顆粒大小有關(guān)，現(xiàn)有的靈敏型流式細(xì)胞儀散射光范圍通常在300-500nm之間。然而，外泌體因粒徑小，通常位于其背景噪聲之內(nèi)，常規(guī)方法無(wú)法對(duì)其進(jìn)行分析及分選。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種利用流式細(xì)胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種利用流式細(xì)胞分選儀獲取指定粒徑外泌體的分離純化方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)置儀器參數(shù)和選擇配件：使用MoFlo Astrios EQ流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行外泌體分選，使用50μm空氣噴射噴嘴(Jet-in-air)，鞘液的壓力為75-80.5psi，樣品流的壓力與鞘液的壓力差值為0.3-0.6psi；閾值設(shè)置為0.01；

在流式分選中，不同大小的空氣噴射噴嘴需要不同鞘液壓力來(lái)維持液流的穩(wěn)定，本發(fā)明中用50μm的噴嘴，只有大于或等于80psi的鞘液壓力才能維持液流穩(wěn)定。

樣品流和鞘液的壓力差決定分選的上樣速度，在本發(fā)明設(shè)置條件下(樣品流的壓力與鞘液的壓力差值為0.3-0.6psi)，液流較穩(wěn)定，且上樣速度使分選效率達(dá)到較高水平。如果設(shè)置其他數(shù)值，會(huì)對(duì)以上兩方面有影響。

(2)利用聚苯乙烯珠，標(biāo)定粒徑為50nm、100nm、200nm和500nm的外泌體顆粒的位置；

(3)利用流式細(xì)胞儀分離純化50-200nm粒徑的外泌體顆粒。